猪传染性胃肠炎病毒Nsp2与宿主细胞蛋白PSMD11相互作用的研究

为确定猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）非结构蛋白2（nonstructural protein 2,Nsp2）与宿主细胞蛋白26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基11（PSMD11）之间是否存在相互作用,本研究利用RT-PCR方法扩增猪源PSMD11基因,并构建其真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11,经测序和双酶切验证正确后,转染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11是否能在IPEC-J2中表达。利用免疫共沉淀（Co-IP）试验检测TGEV Nsp2和宿主细胞PSMD11蛋白之间的相互作用,并通过激光共聚焦显微镜观察TGEV Nsp2与PSMD11在宿主细胞中的共定位情况。结果显示,本研究成功扩增了猪源PSMD11基因,大小约为1 474 bp,基因序列经测序比对与标准序列完全一致。构建的真核表达载体pCMV-Myc-PSMD11能在IPEC-J2细胞中成功表达PSMD11蛋白;Co-IP结果表明,PSMD11与Nsp2之间存在相互作用;共定位试验结果显示,PSMD11与Nsp2的相互作用发生在细胞质中,且细胞中PSMD11蛋白的表达位置并未因Nsp2的表达而发生改变。本研究结果为进一步研究TGEV Nsp2在病毒感染过程中所发挥的重要作用提供新的线索。     

禽流感病毒AM2蛋白相互作用宿主蛋白的筛选及初步验证

采用酵母双杂交系统筛选与禽流感病毒AM2相互作用的宿主蛋白,可为研究AM2蛋白的生物学新功能提供依据。将检测无毒性与自激活作用的诱饵质粒pGBKT7-AM2与淋巴文库质粒进行融合杂交,然后对经选择性培养基筛选到的阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析,阳性克隆进行酵母回转试验验证。经酵母双杂交筛选与验证最终获得2个与AM2相互作用的蛋白。选择线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅱ(COXⅡ)蛋白进行进一步研究,构建真核表达载体pcDNA3.0-HA-COXⅡ,并进行GST-pull down和免疫荧光试验验证。结果表明,COXⅡ与AM2存在相互作用,且在细胞质中存在共定位现象,为进一步研究禽流感病毒的致病机理和病毒-宿主相互作用机制提供了理论基础。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型4种结构蛋白特性分析

为深入了解严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）S、M、E、N蛋白的分子生物学特征和基本结构特征,选取S、M、E、N蛋白序列进行生物信息学分析和预测,使用DNAstar、SignalP、TMHHM、PSORT Prediction、BUSCA和ABCpred软件,分析并相互验证4种蛋白的结构域特征和S蛋白的潜在B细胞抗原表位,结果预测出了4种结构蛋白的功能结构域,并分析预测出S蛋白潜在的B细胞抗原表位为25~29、75~81、112~116、148~152、773~779 aa。研究结果可为SARS-CoV-2相关的分子生物学和结构生物学研究提供参考,并为疫苗开发等提供理论依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白与核糖体蛋白S20相互作用对病毒复制的影响

旨在筛选并鉴定与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)相互作用的宿主蛋白。本试验通过构建猪肺酵母cDNA文库、酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦、过表达和干扰试验等手段,筛选与N蛋白互作的宿主蛋白并研究其对PRRSV复制的影响。结果显示：N蛋白和核糖体蛋白S20(RPS20)在酵母细胞内发生互作,免疫共沉淀和激光共聚焦试验进一步确定N蛋白和RPS20蛋白互作并共定位于细胞质中。过表达和干扰试验证实RPS20能够影响HP-PRRSV在细胞内的增殖。本研究丰富了PRRSV与宿主因子互作的网络,为进一步研究RPS20蛋白在PRRSV感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的亚细胞定位研究

为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组质粒pc DNA3.1/V5His A-E_2经脂质体介导转染至MDBK细胞。继续培养48h后,在激光共聚焦显微镜下观察E_2蛋白在细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,E_2蛋白在细胞核与细胞质中均有表达,且绿色荧光呈点状均匀分布。该研究为进一步研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的相关功能奠定了基础。     

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

US3蛋白激酶是伪狂犬病病毒（PRV）的一个重要毒力因子,研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程,鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2（ANXA2）的相互作用;然后利用RNAi技术,通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析,发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖;进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡,提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员,加深了人们对ANXA2生物学功能的理解。     

猪宿主蛋白G3BP1对猪圆环病毒2型在PK15细胞上复制的影响

猪宿主蛋白G3BP1在宿主抵抗病毒感染过程中起着重要作用,然而还未有相关报道G3BP1与猪圆环病毒2型(PCV2)感染过程中的联系。本文构建了G3BP1真核表达载体和干扰RNA,实现在PK15细胞上G3BP1的过表达及敲低。结果发现,PCV2感染细胞24 h后病毒复制出现显著差异,感染48 h相比于感染24 h病毒复制差异更显著,表明G3BP1能显著促进PCV2复制。过表达或敲低G3BP1后,用干扰素刺激DNA(ISD)刺激12 h, G3BP1能促进ISD诱导IFN-βmRNA的表达;感染PCV2 12 h后,G3BP1也能正调控IFN-βmRNA的转录。本文揭示了宿主蛋白G3BP1显著促进PCV2的复制,很可能是通过上调IFN-β表达引起的。     

分枝杆菌Hsp70对PCV2 Cap蛋白的免疫佐剂作用研究

为了研究分枝杆菌热休克蛋白(Hsp70)对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的免疫佐剂作用,以自聚肽ELK16为纯化标签,分别与Hsp70和PCV2 Cap基因融合后诱导表达,利用离心洗涤法进行融合蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70,其纯度高达95%、96%和85%,产量分别为92、84和83 mg/L;接着用PBS、ELK16-Cap、ELK16-Cap+弗氏不完全佐剂(IFA)、ELK16-Cap+ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70分别免疫小鼠,初免后21 d ELK16-Cap-Hsp70免疫组抗体水平达到最高;在二免后2周取免疫小鼠脾脏淋巴细胞,用试剂盒检测细胞因子表达,TNF-α浓度依次为588.55、802.55、995.55、1 382.55和1 719.55 pg/mL,IFN-γ浓度依次为46.30、92.22、155.56、470.37和518.15 pg/mL,IL-12浓度依次为14.72、28.06、20.83、31.39和34.72 pg/mL。这些研究结果表明,Hsp70对刺激PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生的作用优于IFA,但两者融合蛋白的刺激作用较强;与Cap蛋白融合的Hsp70对刺激TNF-α、IFN-γ和IL-12产生的作用较强,而ELK16-Hsp70+ELK16-Cap对3种细胞因子产生的刺激作用次之。     

多角体蛋白基因核苷酸序列对HBsAg(PreS2+S)在家蚕中表达的作用

应用PCR突变的方法 ,在乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)前S2序列的 5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的 12个碱基 ,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因 (HBMp) ;通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后 ,构建了重组杆状病毒BmPAK HBMp。用重组病毒BmPAK HBMp和BmPAK HBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因 )感染家蚕细胞及蛹 ,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测 ,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了 6 0 %～ 80 % ,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了 8～ 10倍 ;并且HBsAg和PreS2 Ag表达的时相曲线不同 ,PreS2 Ag的表达量比HBsAg早 1～ 2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明 ,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因 (PreS2 +S)的表达。