木薯MeHSF7基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯热激转录因子(HSF)基因MeHSF7并分析其在抗逆响应和采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究MeHSF7基因在响应干旱胁迫及延缓生理性变质的调控机制提供理论参考.[方法]通过同源克隆从木薯叶片克隆MeHSF7基因,对其生物信息学和组织表达特性进行分析,并明确其在干旱和脱落酸(ABA)处理下及PPD过程中的表达模式.[结果]克隆获得的MeHSF7基因开放阅读框(ORF)为1206 bp,编码401个氨基酸残基,与参考序列(Manes.02G087400.1)仅存在2个碱基差异,位于第2染色体上,含有1个内含子和2个外显子.MeHSF7蛋白理论分子量46.1 kD,理论等电点(pI)5.95,为不稳定蛋白,定位于细胞核,无跨膜区域,含有HSF蛋白的保守结构域DBD(DNA结合功能域)、HR-A Core和HR-B Core,属于HSFA亚家族,与橡胶树和麻疯树HSF蛋白的氨基酸序列同源性最高,分别为79.20%和64.95%,在系统发育进化树上与橡胶树HSF蛋白聚在同一小分支,表明二者亲缘关系较近.MeHSF7基因在不同组织中的表达量均较低,但不同组织间存在明显差异,在松散性胚性愈伤组织、分化胚组织、须根和根顶端分生组织中的表达量相对较高,在叶柄中的表达水平最低.MeHSF7基因启动子区域含有ABA响应元件(ABRE)、干旱诱导元件(MBS)和光响应元件(ACE、Box 4)等.干旱处理下,MeHSF7基因表达量随处理时间的增加整体上呈升高趋势,在处理7 d后达峰值;在ABA处理下,处理5和7 d后MeHSF7基因表达量较处理0和3 d后明显上调,尤其在处理5 d后达峰值,表明MeHSF7基因表达受干旱和ABA处理的诱导.在木薯块根的PPD过程中,MeHSF7基因表达量随暗培养时间的增加而升高,处理6、12和48 h的表达量分别是处理0 h的2.1、2.2和3.2倍.[结论]MeHSF7基因可能在转录水平通过依赖于ABA信号通路的途径响应干旱胁迫及木薯块根的氧化胁迫,可作为候选基因用于研究其在木薯抗逆和采后储存中的调控功能.     

木薯ERF转录因子基因MeERF5克隆及表达分析

【目的】克隆木薯ERF转录因子基因MeERF5,并分析其在多种逆境胁迫下的表达模式,为深入研究MeERF5基因在木薯逆境胁迫应答中的调控机制提供参考。【方法】PCR扩增木薯品种华南8号的MeERF5基因编码区(CDS)全长序列,对其进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导法进行蛋白亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeERF5基因在木薯不同组织及多种逆境胁迫处理下的相对表达量。【结果】克隆获得MeERF5基因CDS序列为948 bp,与Phytozome数据库中的参考序列(登录号:Manes.01G085200.1)的核苷酸序列相似性为100.00%,其编码315个氨基酸残基,蛋白分子量为77.84 kD,理论等电点(pI)为5.08,属于酸性蛋白,其二级结构中α-螺旋占16.51%,β-转角占3.81%,无规则卷曲占62.22%,延伸链占17.46%,亚细胞定位于细胞质。通过多序列比对及系统进化分析发现,MeERF5蛋白含有1个AP2/ERF保守结构域,与同属大戟科的橡胶树ERF蛋白氨基酸序列相似性最高(76.8%),亲缘关系最近。MeERF5基因在木薯不同组织中均有表达,其中,在茎中的相对表达量最高,在腋芽中的相对表达量最低。MeERF5基因能快速响应低温胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫、盐胁迫及ABA处理,均出现诱导表达上调的现象,其中,在氧化胁迫下,MeERF5基因的相对表达量持续上升;在干旱胁迫、盐胁迫及ABA处理下,MeERF5基因的表达量先上升后降低;在低温胁迫下,MeERF5基因在处理5 h时的相对表达量达到最大值,之后有所下降,但在处理48 h时再度上升。【结论】克隆获得的MeERF5基因属于AP2/ERF类转录因子,参与木薯多种非生物胁迫应答过程。     

木薯MePYL12基因克隆及采后生理性变质过程的表达分析

[目的]脱落酸受体PYL家族基因为ABA信号通路的重要成员.研究PYL基因在木薯块根的采后生理性变质(post-harvest?physiological?deterioration,?PPD)和非生物胁迫中的功能,能够为进一步研究ABA信号在木薯抗逆和PPD过程中的功能奠定基础.[方法]本研究从木薯品种SC124中通...     

几种抑制木薯采后生理性变质发生方法的比较

比较了热激、酸化和隔绝氧气3种处理对木薯采后生理性变质的影响,结果显示,热激和酸化都能在一定程度上延缓木薯PPD的发生．隔绝氧气是最为理想的抑制木薯PPD发生的方法。因此,通过过量表达或者干扰某些基因表达．降低以至于去除伤口处的氧气的方法将是防治木薯采后生理性变质的有效途径。     

木薯PYL13基因克隆及表达分析

[目的]解析木薯脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCARs家族基因(MePYL13)在木薯块根采后生理性变质(PPD)过程中的功能作用,为后续探索ABA信号通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育种打下基础.[方法]从木薯品种SC8中克隆MePYL13基因,应用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测,对基因上游启动子进行元件分析,通过亚细胞定位观察MePYL13蛋白在植物细胞中的定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测MePYL13基因在木薯PPD过程中的相对表达量.[结果]克隆获得的MePYL13基因编码区(CDS)长度663 bp,编码220个氨基酸,蛋白分子量23.957kD,理论等电点(Ip)为6.74.MePYL13蛋白与巴西橡胶树(XP 021654464.1)PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高,为91.55%,表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性.从MePYL13基因启动子鉴定获得与非生物胁迫逆境相关的响应元件,包括厌氧诱导元件(ARE,AAACCA)、光响应元件(ATCT-motif,AATCTAATCC)、干旱MYB元件(MBS,TAACTG)及ABA应答元件(ABRE,AAACAGA)和分生组织表达相关元件(CAT-box,GCCACT)等;MePYL13蛋白在木薯细胞的细胞核和细胞质上均有表达.随着PPD进程的推移,MeP YL13基因相对表达量整体上呈上升趋势,至PPD后期(48 h)其相对表达量是0h时(PPD前)的16倍,即MePYL13基因受木薯块根PPD的显著诱导.[结论]MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成员,可能在木薯块根PPD过程中发挥正向调控作用,为培育木薯PPD改良品种提供了潜在基因资源.     

木薯2C型蛋白磷酸酶基因MePP2C55的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2C,PP2C)基因是ABA信号途径中主要组成部分,为分析其在木薯非生物胁迫和块根采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration,PPD)中的作用,采用RT-PCR技术从木薯叶片(SC124)中克隆得到MePP2...     

木薯MADS-box基因克隆及其响应乙烯信号的表达模式分析

利用电子克隆技术从木薯基因组DNA中获得1个MADS-box基因,对其理化性质进行分析,并对该蛋白响应激素信号进行研究.结果表明:该基因含有全长为687 bp的ORF,编码229个氨基酸.通过对该蛋白进行ProtScale程序预测表明,该蛋白可能为亲水性蛋白;理化性质分析表明,该蛋白相对分子量为26.1037 ku,等电点为6.87;跨膜结构域预测表明,该蛋白为非分泌型蛋白;亚细胞定位分析该蛋白可能定位于细胞核;磷酸化位点分析表明该蛋白能被丝氨酸激酶所磷酸化.运用定量PCR对该基因响应乙烯信号的表达模式进行分析,结果表明,该基因能够响应乙烯信号,并在外施乙烯12h时具有最高的表达量.本研究为进一步研究该基因响应乙烯信号影响木薯叶片的生长发育提供研究基础.     

木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

木薯采后生理性变质与淀粉特性研究

以华南系列的SC205、SC5、SC6、SC8和SC10五个木薯品种为材料,于采收后不同时间分析其块根生理变质程度、干物质含量、淀粉含量、支链淀粉比例和淀粉透明度等指标,探讨木薯生理变质与块根淀粉特性的关系。研究结果表明:采后生理变质对块根淀粉特性有明显影响,所有品种淀粉特性指标在采后均呈下降趋势,其中下降最快的是SC205。对各指标的相关分析表明,支链淀粉分别与淀粉含量和淀粉透明度呈显著正相关和极显著正相关。可见,生理变质可导致淀粉透明度的下降,影响淀粉的商品品质。     

木薯ERF转录因子调控的靶基因筛选与表达分析

为解析乙烯响应因子（ERF, Ethylene Response Factor）在木薯（Manihot esculenta）生长发育过程中的调控通路,本研究从木薯全基因组数据库中,筛选出启动子区含有GCC-box顺式作用元件的基因204个,利用生物信息学手段对这些基因进行染色体位置分布分析、病原菌侵染下表达模式分析以及启动子结构预测,部分候选基因的qRT-PCR结果表明:Manes.02G189600,Manes.03G039700,Manes.06G002000,Manes.09G063700,Manes.14G141600,Manes.15G181900可能参与调控植物的抗病途径,同时在乙烯介导的信号传递途径中也起重要作用。     

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

[目的]克隆木薯葡聚糖水合双激酶(MeGWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯MeGWD3基因调控及功能研究提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆MeGWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的pCAMBIA2300载体,构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结果]MeGWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸.经序列比对,发现MeGWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM 002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结论]成功构建的植物表达载体pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究.     

木薯NAC转录因子Rd26基因克隆及表达

【目的】克隆木薯NAC转录因子Rd26基因(MeRd26)并检测其在干旱胁迫下的表达量,为Rd26基因抗旱调控机制研究打下基础。【方法】利用反RT-PCR克隆木薯叶片中的MeRd26基因,对其进行序列比对及系统发育进化树构建,研究其在栽培种Ku50和野生种W14间的变异情况,并用实时荧光定量PCR(qPCR)检测PEG-6000干旱胁迫下的MeRd26基因表达量。【结果】从木薯叶片中克隆获得的MeRd26基因,长度为1288 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸,且含NAC保守结构域。系统发育进化树分析结果表明,MeRd26蛋白与杨树(Potri.011G123300.1)和杞柳(SapurV1A.0127s0020.1)的Rd26蛋白亲缘关系较近。基因结构变异分析结果显示,MeRd26基因有33个SNP位点和7个InDel位点,且大部分变异分布在非编码区及最后一个外显子的后半区域。基因表达检测结果显示,在正常大田种植条件下,栽培种Ku50叶片的MeRd26基因表达量是野生种W14的130倍,但在根中表达量差异较小;在干旱胁迫下,栽培种Ku50未展开叶、老叶和根中MeRd26基因表达被快速诱导,表达量随胁迫时间的延长而增加,在根中表达量最高,但在第1片完全展开叶中,MeRd26基因的表达被抑制,其表达量明显降低。【结论】MeRd26基因在转录水平上参与了木薯抗干旱胁迫反应,可作为候选基因用于木薯抗旱机制研究。     

木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析

【目的】克隆木薯锌指转录因子基因MeDi19-1,分析其编码蛋白特征、亚细胞定位、转录激活活性及在木薯不同组织中的表达水平,为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。【方法】从木薯KU50扩增MeDi19-1基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用酵母系统确定其转录激活活性,并基于木薯不同组织转录组数据分析其组织表达特性。【结果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）长度为618bp,共编码205个氨基酸残基,蛋白分子量为22416.79 Da,理论等电点（pI）为6.10,属于不稳定疏水蛋白,含有Di19蛋白家族典型的锌指结构域zf-Di19。MeDi19-1蛋白的二级结构中含有无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）。MeDi19-1蛋白氨基酸序列与橡胶树（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高,为83.50%。MeDi19-1基因启动子元件含有脱落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素响应元件及胁迫响应元件和光响应元件。MeDi19-1蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中,具有转录激活活性,且活性区域在C端。MeDi19-1基因在叶、叶中脉和储藏根中相对表达量较高。【结论】MeDi19-1基因属于Di19基因家族成员,具有组织表达特异性,主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用,其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。     

中国木薯及木薯制成品贸易格局分析

本文通过对中国木薯的生产及木薯制成品的贸易现状进行分析,剖析了木薯及木薯制成品的贸易格局,并就中国未来如何发展木薯产业及如何选择贸易国提出了相关对策建议。     

木薯MePP2CAa基因克隆、表达及蛋白互作分析

为探究2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C， PP2C）在木薯响应非生物胁迫过程中的作用，利用木薯Arg7叶片cDNA扩增MePP2CAa基因，分析该基因序列、启动子活性、不同逆境和激素处理下的表达模式以及与ABA受体PYLs之间的互作关系。序列分析结果显示，MePP2CAa基因全长1 311 bp，编码436个氨基酸，具有PP2C家族的结构域特征，与橡胶树和麻风树的PP2C序列同源性最高，分别为78.95%和74.09%，在C端保守；qRT-PCR分析结果显示，MePP2CAa基因在木薯储藏根中的表达显著高于茎、叶中的表达量；不同逆境和激素处理结果显示，甘露醇、NaCl、ABA、MeJA、低温和SA处理可以显著诱导MePP2CAa基因的表达；MePP2CAa基因启动子序列分析显示，启动子包含ABA应答元件（abscisic acid responsive element，ABRE）、MeJA响应元件、干旱诱导元件等；酵母双杂交结果显示MePP2CAa能够与MePYL1互作。以上结果表明，MePP2CAa基因可能响应木薯的非生物胁迫。     

不同淀粉型木薯品种采后块根变质生理特性的比较

为探明不同淀粉型木薯品种采后块根变质的生理特性,以淀粉含量较高的木薯品种‘辐选01’(RS01)和淀粉含量较低的木薯品种‘华南124’(SC124)为试材,测定采后贮藏0、5、10、15和20d的块根生理指标。结果表明:随着贮藏时间的延长,块根褐化程度逐渐加深,干物质含量和CAT酶活性变化趋势为先下降后上升,淀粉含量为先上升后下降,MDA含量和SOD酶活性为先上升后下降再上升,POD酶活性则表现为持续上升趋势。RS01贮藏过程中块根褐化程度较严重,贮藏第5天褐化面积达30%,而SC124贮藏第20天才开始出现褐化。淀粉含量较高的木薯品种块根干物质含量较高且变化大,失水速率较快,MDA含量较高,SOD、POD和CAT酶活性均较高。可见,块根采后抗变质能力与淀粉含量有密切关系,淀粉含量越高的木薯品种采后块根越容易发生变质。     

木薯SCARECROW-LIKE(SCL)基因克隆、生物信息学及非生物胁迫下表达分析

[目的]克隆木薯SCARECROW-LIKE(MeSCL)基因,对其进行生物信息学分析,并检测其在非生物胁迫下的表达情况,为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考.[方法]以木薯品种D346为材料,采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区(CDS)序列,并利用生物信息学分析软件进行序列特征分析,采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况.[结果]克隆获得的MeSCL基因编码区(CDS)序列全长1655 bp,与参考序列(GenBank登录号LOC110627921)仅存在2个碱基的差异,开放阅读框(ORF)的长度为1560 bp,编码519个氨基酸,编码蛋白分子量为57.84 kD,等电点(pI)为6.08,脂肪系数为80.46%,总平均亲水性指数为-0.195,为亲水性蛋白,含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区,定位于细胞核和内质网中,属于GRAS蛋白家族成员,具有该家族的保守结构域.MeSCL蛋白三级结构模型显示,该蛋白含有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β-转角.MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高,为90.80%,与蓖麻RcSCR、胡杨PeSCL、毛果杨PtSCR、可可树TcSCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右.MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导表达量整体呈升高趋势,但在不同处理时间的表达量存在明显差异,其中,干旱和氧化胁迫下,MeSCL基因均在处理24 h时表达量最高,分别是对照的6.05和11.17倍,而盐和低温胁迫下,MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高,分别是对照的11.76和3.80倍.[结论]MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应,正向调控其抗非生物胁迫能力.     

α-甘露糖苷酶与木薯块根采后生理变质的关系

分析α-甘露糖苷酶与木薯块根采后生理变质(PPD)发生的关系,为有效控制木薯PPD发生提供新思路。采用RT-PCR分析α-甘露糖苷酶基因在块根PPD发生过程中的表达模式,ELISA检测α-甘露糖苷酶活性变化。SC9完整薯块储存5 d后开始出现PPD现象,20μmol/L几夫碱喷施木薯块根切片可显著延缓PPD的发生。随着PPD程度的加重,α-甘露糖苷酶活性显著增高,在储存9 d时达到最大值326.24 U/L。MeMNS1、MeMNS4、MeGMII的表达随着PPD过程而逐步增强,且MeGMII表达最显著,采后9 d SC9块根中MeGMII的表达量达到对照的28.05倍,而MeMNS3-1、MeMNS3-2、MeMNS5表达的变化与木薯块根PPD程度间无明显规律。α-甘露糖苷酶参与木薯块根PPD发生的过程,且α-甘露糖苷酶活性与PPD程度呈正相关,其中MeGMII可能是参与此过程的关键基因。     

木薯MebZIP2基因克隆及其功能分析

【目的】bZIP转录因子在植物生长发育、淀粉合成和非生物胁迫等方面发挥重要作用。克隆木薯MebZIP2基因并进行亚细胞定位、表达分析和酵母单杂交分析,为进一步研究MebZIP2基因的功能提供参考。【方法】从木薯SC205中扩增MebZIP2基因编码区（CDS）序列,对其进行生物信息学分析,并构建pNC-GreenSubN融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定MebZIP2蛋白的亚细胞定位情况。在木薯不同组织和块根不同发育阶段分析MebZIP2基因表达特征,利用酵母单杂交研究其与淀粉合成基因启动子的互作情况。【结果】MebZIP2基因CDS序列长度为465 bp,编码154个氨基酸,蛋白分子量为17 891.35 Da,理论等电点为5.23,属于不稳定亲水性蛋白。MebZIP2含有bZIP保守结构域,其氨基酸序列与橡胶树bZIP蛋白的相似性最高,为74.22%。MebZIP2基因启动子区域含有光响应元件,赤霉素、水杨酸和茉莉酸等激素响应元件,以及胚乳表达和胁迫响应元件。MebZIP2蛋白亚细胞定位于细胞核和细胞膜。MebZIP2基因在根尖分生组织、须根、茎和块根...     

木薯块根采后贮藏研究进展

木薯是三大薯类作物之一,是非洲和南美洲国家的主要口粮。由于其采后易腐烂(2～3 d)导致木薯块根的利用受到很大的限制。近年来,随着木薯生物技术研究的发展,块根采后生理的研究不断获得重大突破。对木薯块根采后贮藏的生理特性以及影响因素和主要机理进行综述,以期为木薯块根采后处理技术和木薯选育种提供参考。