猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50 min,Mg~(2+)和dNTPs浓度分别为8.0 mmol/L和4.0 mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1.4。特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10~(-5)mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10~(-3)mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好。利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测。阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV。52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08%(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31%(9/52),二者的符合率为94.23%。以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点。且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

刺激隐核虫LAMP检测方法的建立

为提高大黄鱼刺激隐核虫病的病原体检出率,本研究针对刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans) 18S-ITS2基因序列设计4条LAMP引物,在内外引物浓度比2∶1～6∶1、Mg2+浓度2 mmol/L、反应温度61℃～66℃、反应时间60 min的优化条件下,扩增产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带.本研究建立的LAMP方法具有高灵敏度(10-7 ng/μL DNA浓度),比常规PCR方法高100倍.将该方法应用于采集自不同地域的虫体样本、病鱼和水样以及不同组织样品的检测,结果在13份样品中有10份检出阳性,并显示该方法既能够检测发病鱼,也能够检出已感染但未发病的鱼.实验表明,该方法是一种能够快速、简易、特异、敏感地检测海水鱼类刺激隐核虫病的病原学检测方法.     

H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测技术

根据GenBank中H5N1亚型流感病毒HA基因保守区的序列,设计1组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP反应体系,优化LAMP反应条件,最佳等温扩增反应条件为65℃保温60min。扩增后产物加入核酸染色剂SYBRⅠ和4 mmol/L Mg2+,结果可视。扩增产物可用特异性内切酶KpnⅠ进行酶切鉴定。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法一致。RT-LAMP技术整个检测过程只需1~2 h,不需要PCR仪和成像系统,仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验,验证了建立的RT-LAMP技术可以作为一种操作简单,灵敏性、特异性高的检测H5亚型禽流感病毒的方法。     

狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

利用正交设计,从Mg2 、dNTP、引物浓度和DNA聚合酶4种因素3个水平以及不同的模板DNA浓度来优化狗牙根SRAP-PCR反应体系,并对引物进行了全面筛选。狗牙根SRAP-PCR优化反应体系结果为:2μL 10×buffer4、0 ng模板DNA、Mg2 1.25 mmol/Ld、NTP 260μmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL。运用该结果从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物34对。优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础。     

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。     

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR-PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2 和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选.结果确定了星星草ISSR PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存.20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2 2.0mmol/L.     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。     

野火球RAPD反应体系优化研究初报

为建立一个稳定的野火球RAPD反应体系,对RAPD反应条件中模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2 浓度和dNTP浓度等各项参数进行筛选比较,创建其最佳反应体系为;250μl反应体系中,模板DNA51ng,Taq DNA聚合酶0.5U.引物浓度0.32μmol/L,Mg2 浓度1.2mmol/L,dNTP浓度0.20mmol/L,10×PCR Buffer 1.0μl,ddH2O19μl.     

基于ORF3基因检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究参照已有的研究报告,对PEDV ORF3基因序列进一步比较优化,选择PEDV ORF3更为保守的序列设计引物,经PCR扩增目的片段后构建了 PEDVORF3基因的重组质粒标准品pMD18-T-ORF3,以其为模板,经反应条件优化,建立了基于PEDV...     

新型鸭呼肠孤病毒可视化检测方法的建立与应用

为了快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),试验针对NDRV保守序列设计特异性引物,将RT-LAMP技术与荧光染料钙黄绿素结合,建立NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法,并对该方法的反应温度、时间及体系进行优化,检测该方法的特异性和敏感性,同时采集12份临床疑似NDRV感染的病料分别用钙黄绿素可视化RT-LAMP方法和常规RT-PCR方法进行检测,比较两者的阳性检出率。结果表明:成功构建NDRV钙黄绿素可视化RT-LAMP快速检测方法;优化后的反应温度为66℃,反应时间为50 min,反应体系中Mg~(2+)浓度为3.0 mmol/L,甜菜碱浓度为0.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.3 mmol/L,Bst DNA聚合酶的浓度为0.32 U/μL,AMV反转录酶的浓度为0.14 U/μL,内外引物浓度比为10∶1,环外引物浓度比为4∶1。该方法可特异性检测出NDRV;对NDRV的最低检测量约为200 fg;用该方法对临床疑似NDRV感染的病料进行检测,阳性率为91.67%,而常规RT-PCR方法阳性率为83.33%,并且钙黄绿素可视化RT-LAMP方法能通过颜色变化观察反应结果。说明试验建立的RT-LAMP检测方法特异性好,敏感性强,读取结果更方便直观。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。     

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法，本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，设计2对特异性引物，经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV，并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示，该方法的最适退火温度为59℃，扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示，除Pm和RHDV有特异性扩增条带外，其余相关病原均无扩增条带，特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板，经该双重PCR方法扩增。结果显示，该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，敏感性较高；对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致，重复性较好。对100份临床...     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+, dNTPs,引物, Taq DNA 聚合酶及DNA 模板浓度进行优化。结果表明,适于杨桃研究的SCoT-PCR最佳反应体系为：总体积为20μL的反应体系中,含2.5mmol/L Mg2+,0.3mmol/L dNTPs,30mg/L模板DNA,1.00μmol/L引物和0.4U Taq DNA聚合酶。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物(1对内引物、1对外引物),进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料(dNTPs)、内外引物比例、Mg~(2+)浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

应用二温式PCR检测家蚕核型多角体病毒的方法

为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(Bm NPV),以Bm NPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(Gen Bank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染Bm NPV(广西宜州分离株)2 h的5龄家蚕幼虫中肠组织提取的DNA为模板,建立二温式PCR检测Bm NPV的方法,最终确定的最佳反应体系为:10×PCR buffer 1.5μL,5 mmol/L Mg Cl22μL,2.5mmol/L d NTP 0.5μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL,18 ng/μL模板DNA 1μL,加水至总体积15μL。确定的最佳反应条件为:94℃预变性3 min;95℃15 s,延伸和退火温度合并为62℃30 s,共25个循环。按上述条件PCR扩增得到大小约309 bp的特异性片段,测序结果与已知polh基因序列的相似度为100%。与普通PCR检测方法比较,采用二温式PCR方法对样本的检测时间节省1.5 h,反应特异性强,灵敏度高(能被检测的最小感病组织基因组DNA的质量浓度为1.8 pg/μL),并且选择最初2 h感病的幼虫中肠组织为检测材料,因而可用于家蚕血液型脓病的早期诊断。     

桑天牛遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立

建立适合的AFLP反应体系研究桑树主要害虫桑天牛(Apriona germari)的遗传多样性,有助于从分子水平分析桑天牛不同地理种群的遗传多样性以及开辟害虫防治新途径。对提取的桑天牛成虫基因组DNA预扩增中的Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量以及选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度和Taq酶的用量等进行单因素试验,优化反应体系。确定预扩增反应体系中的Mg2+终浓度为1.50mmol/L,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为10.0×10-7mol/L,Taq酶用量为1.00U;确定选择性扩增反应体系中的预扩增产物稀释倍数为40倍,dNTP终浓度为0.15mmol/L,引物浓度为5.00×10-7mol/L,Mg2+终浓度为1.50mmol/L,Taq酶用量为1.00U。用优化后的反应体系扩增得到了条带清晰的桑天牛AFLP图谱。     

沙门菌fimA-LAMP快速检测方法的建立及其应用

研究针对沙门菌保守菌毛fim A基因,设计4条两对特异性引物,建立快速检测沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,并对反应温度、检测特异性和灵敏度等反应条件进行一系列优化,与常规PCR进行比较,及对临床样品进行检测。结果显示:LAMP方法最适反应温度为64℃,Mg~(2+)浓度为8 mmol/L,d NTPs浓度为0.8 mmol/L,内外引物浓度比为1∶8;对6种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅沙门菌扩增阳性;对沙门菌检测的灵敏度为8.6×101cfu/m L,比PCR灵敏10倍;对市场肉类产品检测,LAMP与传统方法符合率为100%。试验表明,建立的沙门菌LAMP方法特异性强、灵敏度高、结果可视,且操作简单,无需昂贵的仪器,适合基层实验室和食品监测部门应用。     

珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。