猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立

本文根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(Single cross priming amplification,SCPA)进行扩增及优化反应体系,并结合核酸试纸条技术(Nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。KHV-SCPA法可在63℃下60min内实现循环扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法提高约1000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。     

同时检测CSFV、PRRSV的二重RT-PCR方法的建立及其在临床样品检测中的初步应用

建立了1种一步法RT-PCR用于同时检测典型猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖呼吸道综合征病毒(PRRSV)的多重PCR诊断方法(Multiplex PCR,mPCR)。根据Genbank上公布的CSFV、PRRSV基因组全序列及部分序列,借助DNAStar和Oligo6.0基因序列和引物设计软件,设计2对特异性引物分别用于扩增CFSV、PRRSV病毒777bp和434bp的目的片断。该mPCR由RT反应和PCR反应构成。将病毒核酸连接到PMD18-T载体,提取质粒后,以10倍进行倍比稀释,取每个稀释度的病毒核酸进行mPCR反应,对CSFV、PRRSV的最低检测量分别为8.5pg、8.3×10-2pg。以PCV2、PCV1、PPV、PRV、SIV、E.coil和双蒸水为模板进行mPCR反应,扩增结果均为阴性,表明该mPCR具有较好的特异性。对临床样品的检测表明,本研究建立的mPCR诊断方法能够对CSFV和PRRSV进行快速的诊断,同时对CSFV、PRRSV在猪群中的流行病学调查也具有十分重要的意义。     

浅谈环介导等温扩增技术及其在动物病毒病检疫中的应用

<正>当前动物疫情复杂多样,动物疾病的诊断技术显得尤为重要。准确、快速、直观的诊断技术成为人们研究的热点,环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)应运而生,它是一种新颖的核酸扩增技术,具有简单、快速、特异性强的特点,特别适合现场快速检测及基层普及应用,目前已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体和转基因食品、胚胎性别的检测中,并得到了欧美国家的认同,预计在动物病毒病检疫中有广阔的应用前景。1环介导等温扩增技术1.1概述环介导等温扩增技术(LAMP)是由Notomi T等在2000年发明的一种全新的核酸扩增技术。该技术主要利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,使反应中在模板两端     

重组酶快速检测十足目虹彩病毒1方法的建立

为建立十足目虹彩病毒1的快速检测方法,根据十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(ORF114R)保守序列设计特异性引物,通过条件优化,建立基于重组酶聚合酶扩增技术的十足目虹彩病毒1检测方法.重组酶聚合酶扩增技术的最优扩增温度为30℃,恒温反应20 min内即可完成.特异性试验结果显示,该方法与其他常见虾类感染病毒无交叉反应....     

猪流行性腹泻病毒诊断技术概述

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种能够导致哺乳仔猪出现严重肠道疾病的病原,危害严重。因此,正确且快速地诊断PEDV感染对于该病毒的防控至关重要。目前已经研究出一些诊断方法可有效用于PEDV蛋白质或核酸的检测,包括病毒分离,免疫荧光(IF),免疫组化(IHC),聚合酶链反应(PCR)和等温扩增测定。另外,也研究出了几种血清学测定方法,用于检测PEDV的抗体。就PEDV当前的诊断方法进行概述,比较它们之间的优劣,为临床诊断和实验室研究提供参考。     

对虾白斑综合征病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因保守序列,利用PrimerExplorer V4设计合成4套环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)特异性引物,每套引物包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和一条环引物(LF或LB)。利用钙黄绿素作为检测指示剂,建立了可视化WSSV的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。以构建的pMD18-WSSV重组质粒为标准模板进行10倍梯度稀释,测定LAMP对WSSV核酸的最低检测限,4套引物组分别建立LAMP方法均在63℃恒温条件反应60 min,结果显示WSSV-2、WSSV-3和WSSV-4的最低检测限分别为2.25～0.225、2.25～0.225和225～22.5 copies/μL。本研究建立的LAMP方法在1 h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果,适用水产养殖的现场检测,为WSSV早期感染的快速检测提供了方法。     

规模化猪场猪圆环病毒3型的检疫及防控

猪圆环病毒3型(porcive circovirus type, PCV3)是近年来发现的一种新型病毒,可对猪群造成严重影响。介绍了PCV3病毒及其危害,并阐述了规模化猪场中PCV3病毒检疫方法,包括血清学检测、RT-PCR和测序技术等,提出了有效防控该病毒的建议,以帮助规模化猪场早期发现和及时控制PCV3病毒,减轻其对猪群健康和养殖业发展的影响。     

猪瘟检测技术的研究进展

目的:综述猪瘟检测技术的最新研究进展,以期为猪瘟检测及防控工作提供参考。方法:从猪瘟临床症状与病变、病原鉴定、血清学检测、分子生物学检测等方面对猪瘟诊断进行讨论。结果:原有的国际贸易所认可的NPLA、FAVN和ELISA一直延续使用同时,而胶体金猪瘟检测技术、ELISA、分子生物学检测技术在不断的优化和创新,更有环介导恒等温扩增试验(LAMP)、数字PCR试验等新的检测技术的建立和应用。结论:猪瘟临床表现多样性,单纯依据临床和病理学资料难以诊断,需要一种或多种实验室检测技术才能确诊。     

LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用

近年来,一种新的恒温核酸扩增方法LAMP法(loop-mediated isothermal amplification),即环介导等温扩增法已经被开发利用。它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在恒温条件(60~65℃),不到1h的时间里进行核酸扩增,其扩增效率可达到109~1010个数量级,具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。LAMP法已经被用来快速检测水产动物病原(细菌、病毒、寄生虫)。文章就LAMP法的反应原理、引物设计及其在水产动物病原快速检测中的应用等做简要的综述。     

检测与诊断猪圆环病毒PCR技术的建立及病毒的分离鉴定

本研究建立了检测与诊断猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究。该方法快速、敏感、特异性强,可扩增10ng的阳性质粒的DNA,可以从30μL病料组织悬液或全血中扩增检测出PCV,并且该方法可以区分PCV1和PCV-2,对其它病原微生物如PPV、PRRSV、SIV以及许多细菌不能检出。应用此方法对6省市的12个猪场的225份病料进行了检测,对阳性病料进行了病毒分离,对分离的病毒进行了电镜观察与序列测定,结果证实分离的病毒为PCV-2。     

2种核酸快提取法对羊口疮病毒和羊痘病毒DNA提取效能的比对研究

目的 合理选择病毒快速核酸提取方法。方法 分别采用2种商品化核酸快提取法——Cell-to-cDNA裂解液(A法)和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A,B法),提取羊临床样品中的羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(CaPV)核酸，使用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)和重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)方法进行平行检测，并与常规核酸提取方法(宝生物病毒DNA/RNA提取试剂盒，C法)比较。结果 与C法相比，在A法和B法提取的46份疑似orf拭子中，qPCR的ORFV核酸检出率分别为70.8%和87.5%,RPA-LFD的检出率分别为69.5%和82.6%;在A法和B法提取的52份疑似CaP的拭子样品中，qPCR的CaPV核酸检出率分别为77%和90%,RPA-LFD的检出率分别为65.5%和89.7%。对组织样品分析发现：A法不能用于组织样品的核酸提取；在B法提取的52份疑似orf组织样品核酸中，与C法相比，qPCR的ORFV核酸检出率为93.7%,RPA-LFD的检出率93.3%;对B法提取的61份疑似CaP组织样品核酸中，qPC...     

鲤浮肿病检测方法实验室间比对的结果与评价

鲤浮肿病(carp edema virus disease,CEVD)是在锦鲤中发现的一种传染性病毒病,近年来在全球传播迅速,对鲤养殖业造成严重损害。本研究设计CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行特异性实验;选取套式PCR、荧光PCR和LAMP三种检测方法,组织10家实验室进行室间比对测试:制备含CEV病毒核酸的测试样品,评价其均匀性和稳定性,通过测试结果分析方法检出限。结果显示,套式PCR的核酸样品检测限可达6.8×10^-10 g。     

嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）分别建立嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）与温和气单胞菌（A.sobria,AS）的快速检测方法。针对嗜水气单胞菌pilin基因、温和气单胞菌zipA基因设计特异性LAMP引物。在恒温条件下利用实时浊度仪对2组引物进行特异性和灵敏度试验,并以琼脂糖凝胶电泳和核酸染料颜色变化对扩增结果进行判定。结果显示,LAMP实时浊度法能够特异地检测嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,最低检出限分别为46 fg·mL^-1和320 fg·mL^-1,是普通PCR方法的104倍和102倍;并能应用于已知临床样品检测。该研究建立的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌LAMP快速检测方法具有高效、特异、灵敏的特点。     

WSSV和IHHNV对虾病毒的胶体金免疫层析快速检测

为了快速、方便地检测出这2种病毒,研究将PCR核酸扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析技术快速、简便、直观的优点结合起来,建立了同时检测2种对虾病毒(WSSV和IHHNV)的同步PCR-胶体金免疫层析检测方法。采用了生物素标记和地高辛(Digoxigenin)标记引物。PCR扩增产物利用胶体金免疫层析技术进行检测。胶体金免疫检测试剂条的检测线(T线)处的层析膜处点上地高辛的单抗,经地高辛标记的PCR扩增产物可在T线上被检测到,在10 min内即可得到检测结果。同时,在PCR过程中使用UNG(尿嘧啶-DNA糖基酶),极大地控制了遗留污染。通过此方法检测对虾WSSV和IHHNV病毒的灵敏度均可达到10~100个拷贝,高于国家标准PCR检测法10~100倍。此检测方法让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂,免除基层检测实验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

PCR法在鸡毒支原体污染检测中的应用

[目的]利用PCR技术,探究鸡毒支原体(MG)的检测方法。[方法]针对MG脂蛋白的基因序列,建立PCR扩增体系,测定其灵敏度和特异性,并对鸡胚样品进行检测。[结果]PCR扩增得到了400bp的基因片段,最低检出浓度为0.2 pg·μL~(-1);该PCR法仅与MG的DNA反应,与大肠杆菌、猪肺炎支原体、新城疫病毒、沙门氏菌的DNA或cDNA反应结果均为阴性;利用该PCR对鸡胚样品进行检测,核酸阳性率为76%。[结论]该研究初步建立了基于MG脂蛋白基因的特异性PCR检测方法,为MG的临床检测奠定了基础。     

PCV2d已成为猪圆环病毒2型的优势流行基因型

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原,PCV2的感染可使猪场种猪的繁殖效率下降、仔猪的生长性能下降、饲料报酬降低等,给猪业造成巨大的经济损失。疫苗免疫是防控该病的有效手段,然而PCV2变异较快,主要临床流行毒株已从PCV2b逐渐演变为PCV2d,现有商业化疫苗免疫效果需进一步研究证实。就近年来我国PCV2流行毒株的转变,以及商业化PCV2疫苗的毒株亚型进行分析,旨在为猪圆环病毒相关疾病的防控及疫苗的选择提供参考。     

鲤浮肿病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus, CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L, Betaine0.7 mol/L, Mg~(2+) 8.0 mmol/L, dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍; CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。