基于CMV启动子构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统

构建了一种利用CMV启动子的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)反向遗传操作系统。在获得XX-2012株HP-PRRSV全长cDNA的基础上,将CMV真核启动子序列置于该病毒全长cDNA的5′端,获得含有CMV启动子和XX-2012株HP-PRRSV全长cDNA克隆的重组质粒,将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞拯救病毒。结果显示:转染细胞后获得了拯救病毒,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记(突变产生的MluⅠ酶切位点)。本试验建立了一种简单、操作方便、节约时间和成本的HP-PRRSV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展HP-PRRSV的相关研究奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台.     

5'端非病毒核苷酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆拯救的影响

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID₅₀/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID₅₀/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是严重危害养猪业的病原,论文概述了PRRSV的生物学特性和基因组的结构及编码的结构蛋白,综述了PRRSV新型疫苗、反向遗传技术和分子诊断的研究进展,为PRRS的预防和诊断提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传技术的研究进展

反向遗传操作技术可以在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而可以对病毒基因组的表达调控机制、病毒致病的分子机理等进行研究。本文就反向遗传操作技术在PRRSV基因功能结构研究以及新型疫苗开发等研究中的应用进行了综述。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

为了对从湖南某发病猪场送检的血清中分离到的1株蓝耳病病毒进行鉴定,试验通过接种Marc-145细胞传代后产生明显而稳定的细胞病变,又经过RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)检测成功验证;通过对分离株的ORF5基因的测序结果表明,ORF5核苷酸序列与欧洲型代表株LV株及北美经典毒株VR-2332、国内经典美洲株CH-1a的相似性分别为64.5%、87.4%、93.0%,说明其属于美洲型;而将NSP2高变区的测序结果与JXA1等高致病性变异株的Nsp2比较后发现,都在同一位置不连续缺失30个氨基酸。说明成功分离到1株北美型变异株,最终将其命名为PRRSV CZ-HN株。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株对仔猪致病性的比较

为了比较最新分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异分离株SY0608和传统毒株S1对仔猪的致病性,本研究选择9头30日龄商品仔猪,随机分为2组,分别接种2株病毒,即S1株感染组(n=5头),SY0608株感染组(n=4头),接种后隔离饲养观察2周。经临床症状观察、病理学、病原学和血常规学检查,结果:SY0608毒株感染组仔猪表现明显临床症状,接种3 d后体温急剧升高至41.8℃;白细胞数急剧减少(降低了45%);病理学变化严重,肺泡膈增宽,大部分肺组织肺泡不张;而S1株感染组仔猪仅出现轻微临床症状和病理变化。SY0608毒株感染组仔猪病毒血症持续时间较S1毒株感染组长,病毒在脏器中的分布更为广泛。SY0608株感染组血清ELISA抗体水平明显高于S1株感染组。结果表明,SY0608毒株对仔猪致病作用明显强于S1毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株的致病性研究

为了解PRRSV安徽分离株的致病性,用从安徽省某发病猪场的病死仔猪组织中分离到的SCH07毒株接种40日龄健康仔猪,对其进行临床症状、病理剖检、病理组织学观察及抗体检测,结果表明：该毒株能引起仔猪高热、呼吸困难等明显临床症状和肺脏、淋巴结肿大、出血等剖检变化,病理组织学观察可见显著的间质性肺炎等病变,攻毒后第7天试验组仔猪血清中首次检测到抗体,并有一头在第15天死亡,证实安徽省已经出现临床高致病性PRRSV毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种传染病,该病主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病,导致高死亡率,生长发育受阻,给世界养猪业造成了巨大的经济损失.PRRSV基因组存在高度变异性,美洲型和欧洲型的核苷酸序列差异较大,不同的ORF序列同源性存在不同程度的差异.论文就PRRSV基因组的遗传变异进行分析,对研究PRRS的致病机制、免疫机理及制定相应的防控措施有一定的指导意义.     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究概况

猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状的急性热性接触性传染病。该病是威胁养猪业的主要传染病之一,给养猪业带来极大危害。目前对该病缺乏有效的治疗手段,疫苗免疫接种是主要的防控措施。尽管市场上的灭活疫苗和弱毒活苗具有一定的保护作用,但都存在一定局限性。基因工程疫苗具有生产工艺简单,安全高效等优点,但仍处于实验室研究阶段。论文对猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展进行综述,以供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

查明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)致病性大幅增高的机制,进而研制用于防治流行PRRSV变异株的高效疫苗无疑是兽医工作者的当务之急.在弱毒株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS以及我室构建的高致病性HP PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,构建了nsp2替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆.将构建的嵌合克隆转染MA104,4d后观察到典型的CPE.通过RT-PCR和免疫荧光证明获得了一系列强弱毒株之间的嵌合病毒.这些嵌合病毒的构建成功和相应反向遗传操作平台的建立及应用,为研发预防HP PRRSV的高效嵌合疫苗奠定了基础.该类嵌合感染性cDNA克隆也为解析目前流行的HP PRRSV毒力因子和高致病力机制奠定了基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染的诊治

通过对两猪场送检的发病猪血样或病料进行RT-PCR和血清学检测,并结合临床症状观察和病理剖检,确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染,经采取综合防制措施,取得了较好的疗效。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原体,本文对PRRSV的分子生物学研究进展进行了综述,主要包括PRRSV的基因组结构、病毒蛋白及其功能、抗原变异等,旨在为诊断技术、免疫机理研究、疫苗设计与疫病防制提供借鉴.     

猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展

猪繁殖与呼吸综合征是一种引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状及高死亡率的传染病。已几乎遍极世界所有养猪国家,在中国的流行和分布也日益广泛,危害日益严重。此病的传播给世界养猪业造成严重经济损失,受到国内外学者的高度重视,对此病的研究也正在逐渐深入,特别是免疫学及其疫苗的研究正日益受到关注。文章就猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研究进展和使用现状做了系统地阐述,特别是通过合理地选择和使用免疫佐剂,如γ干扰素、霍乱毒素及可溶性β葡聚糖等来改进疫苗作用方面进行了阐述。     

猪繁殖与呼吸综合征的研究

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的高度传染性病毒病。笔者就PRRS病毒的生物学特征、理化特性、基因组结构蛋白、免疫学特征以及疫苗等方面作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株感染性克隆的构建

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统,本实验采用RT-PCR方法将PRRSV-XH株的基因组序列分为6个片段进行扩增,连接至低拷贝载体pOKQ中,获得全长cDNA克隆。将该克隆体外转录,经脂质体转染Marc-145细胞,观察细胞病变。经RT-PCR、间接免疫荧光和western blot等试验验证,表明构建了具有感染性的PRRSV-XH株全长cDNA克隆。本实验为在分子水平上研究PRRSV的复制、致病机理和基因产物的功能等方面提供技术支持,并为构建新型病毒载体和开发安全有效的活病毒疫苗奠定基础。