中国与美国RFLP 1-4-4 lineage1C变异株同一分支PRRSV的全基因组序列分析

2020年美国报道了高致病性的RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株,其对猪的致死率达到17.5％.为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前流行的PRRSV的关系,本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变异株进行遗传演...     

PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。     

甘肃省规模场猪PRRSV变异株疫苗免疫抗体检测与分析

【方法】采用间接ELISA方法,对采自23个规模场户的419份血清,进行PRRSV变异株疫苗免疫抗体检测。【结果】17个场户免疫抗体合格率在70%以上,平均合格率为79.71%,其中种猪为90.52%、保育猪为80.17%,育肥猪为70.48%;11个灭活疫苗免疫场户中有6个场户免疫抗体合格率在70%以上,平均抗体合格率为71.48%,12个弱毒疫苗免疫场户中有10个场户免疫抗体合格率在70%以上,平均抗体合格率为87.55%。【结论】灭活疫苗免疫种猪、保育猪和育肥猪抗体合格率存在明显差异,弱毒疫苗免疫种猪和保育猪与育肥猪抗体合格率之间存在明显差异。     

广东历年PRRSV流行毒株与疫苗株的重组分析

从GenBank上可查的全部424株猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）全基因序列中筛选出了42株来源于广东的PRRSV毒株全基因组序列与6株PRRSV疫苗株全基因序列,用RDP4(Recombination detecting program 4,RDP4)软件进行重组分析。发现广东株之间的重组事件集中在2010年、2011年和2015年。JXA1-RCN-2009作为亲本毒株出现在12个重组事件中,重组体的年份从2010年延续到2018年。疫苗株Ingelvac ATP-US-2006与CH-1R-CN-2008作为次要亲本毒株出现在事件10中,该事件的重组体为广东2018年的毒株。在事件18和25中可以见到疫苗株之间的重组,但软件同时显示该事件可能是自然进化而非重组。该研究对广东猪场科学规范的使用弱毒疫苗有着一定指导意义。     

我国近5年类NADC30 PRRSV毒株序列的重组及限制性片段长度多态性分析

为了解我国类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的流行和遗传变异情况,本研究利用生物信息学软件对本实验室2016-2020年获得的64条类NADC30毒株序列进行分析。Nsp2氨基酸序列比对结果表明,64株毒株均表现出与NADC30毒株一致的131个不连续的氨基酸缺失。其中,9株在Nsp2区域除该缺失特征外,另含有额外的氨基酸缺失。基于全基因组遗传演化分析结果表明,61株分布在Sublineage 1.8(类NADC30),3株分布在Lineage 8(HP-PRRSV)。而基于ORF5序列的遗传演化分析结果则更分散,56株分布在SubLineage 1.8,5株分布在Lineage 8,2株分布在Lineage 5(类VR2332),1株分布在Sublineage 1.5(类NADC34)。经RFP4和Simplot生物学软件进行重组分析结果表明,64株毒株中可能有44株为重组毒株,共表现出5种重组模式,其中以NADC30提供骨架,HP-PRRSV提供重组片段为主要模式。重组热点分布在非结构蛋白区域5′UTR～1 500 nt(Nsp1)、5 374～8 177 nt...     

猪繁殖与呼吸综合征 病毒类NADC30毒株的新近流行

猪繁殖与呼吸综合征是严重危害养猪生产的病毒性传染病.自20世纪90年代中期在我国发生和流行以来,已经20余载.据田间流行优势毒株的不同,可大致分为三个阶段:经典毒株流行阶段(1995—2006年)、 高致病性变异株流行阶段(2006—2013年)和新近的类NADC30毒株流行阶段(2013年至今).2013—2014年间与美国分离株NADC30亲缘性较高的一类PRRSV毒株开始在我国暴发流行,其具有与NADC30和MN184等谱系1(lineage 1)毒株相同的nsp2编码区缺失模式.致病性分析及疫苗保护试验结果表明,其致病性介于高致病性毒株与经典株之间,目前商用疫苗对其保护效果不佳.且类NADC30毒株易与其他PRRSV毒株发生重组,产生新的变异株.类NADC30毒株的广泛流行,以及相关重组毒株的叠现,进一步增加了PRRS疫病防控的难度.     

一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及遗传变异分析

为了解广西地区的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异及流行情况,本实验室从广西某发病猪场采集到的猪肺脏组织中检测到1株PRRSV,命名为GXNN1839,并对该毒株进行病毒的分离鉴定、GP5和Nsp2的测序分析.结果 显示:该毒株可在PAM细胞上分离增殖,有明显的细胞病变,通过IFA试验可以检测到细胞内PRR...     

高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染的研究

应用RT-PCR技术对来自广东省某猪场患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪肺脏组织进行检测,结果初步鉴定为PRRSV高致病性变异株(YGhp株)与经典株(YGcl株)混合感染.进一步对2个毒株的NSP2基因进行序列分析,结果发现YGhp株与VR-2332、JXA1和Lelystad株的核苷酸同源性分别为75.1%、99%和35%,而YGcl株与上述毒株的同源性分别为99%、77.7%和34.5%,表明YGhp株为高致病性变异株,YGcl株为经典株,均属美洲型. 高致病性PRRSV变异株与经典株混合感染属非常罕见.     

外来与新发动物疫病猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like变异流行情况及综合防控措施

猪繁殖与呼吸综合征在我国流行已20余年,但其病原变异的复杂程度在进一步加大,流行程度也并未明显减弱,特别是2013年以来NADC 30-like毒株的出现导致了PRRS再次大范围流行。近年来PRRSV重组变异毒株越来越多,因此了解其流行情况以及防护措施,对进一步防控该病及保障我国生猪健康养殖具有重要意义。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)对类NADC30 PRRSV免疫保护效果的评价

类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已成为我国PRRSV的主要流行株,为了评价当前商品化疫苗对类NADC30 PRRSV的免疫保护效果,本研究将12头6周龄仔猪随机分为3组,免疫组和攻毒对照组各5头、空白对照组2头,免疫组肌注高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)105.0 TCID50...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异野毒株与JXA1-R疫苗毒株快速鉴别方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）变异野毒JXA1的基因变异序列和疫苗株JXA1-R的基因遗传标志设计合成了2对特异性引物,结合快速RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立了JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒的快速鉴别体系,其目的片段大小分别为400、290 bp,该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒的PCR检测结果均为阴性;对JXA1变异野毒与JXA1-R疫苗毒RNA的最低检测量分别为103、104拷贝/μL。该方法敏感、特异,适用于临床样品的检测。     

1株重组类NADC34猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定与基因组特征分析

为分离天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染的样品进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将出现细胞病变的PAMs进行有限稀释后进行间接免疫荧光鉴定,利用RT-PCR扩增分离纯化株全基因组序列并进行同源性及遗传进化分析,并对分离株进行重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,分离获得1株PRRSV毒株(命名为TJbc2021),分离毒株不能感染Marc-145细胞;该毒株全基因组长为15 111 bp,与NADC34的核苷酸同源性最高,为95.2%,属于目前流行于中国的类NADC34 PRRSV,其Nsp2存在100个氨基酸缺失的分子特征;重组分析显示该毒株以谱系1.5毒株(NADC34-like)为主要亲本,以谱系1.8毒株(NADC30-like)为次要亲本,在14 082～14 635 nt(ORF6～ORF7)发生了基因重组。结果表明,分离并鉴定了1株重组类NADC34 PRRSV,可为该地区...     

犬瘟热病毒疫苗变异株的分离及其P1蛋白的表达、鉴定

从河北某宠物医院病犬的脾脏中分离到1株犬瘟热病毒,H基因测序结果表明,该分离株与疫苗株的同源性为99.5%,有3个氨基酸突变,但不影响其糖基化位点。将该株病毒P1基因克隆到pET32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)及Rosetta感受态细胞,在IPTG诱导下获得大小为50 ku,可溶性表达的P1重组蛋白。Western blotting、间接ELISA试验结果显示表达产物能被犬瘟热高免血清所识别,表明其具有良好的反应原性,有望用于犬瘟热的检测。     

一株重组类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组分析

为分离上海地区猪繁殖与呼吸综征病毒（PRRSV）并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染病猪的2份肺样进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将盲传3代后出现细胞病变的PAMs经间接免疫荧光鉴定,通过RT-PCR扩增分离株全基因组序列,测序后与GenBank登录的参考株全基因组序列进行同源性及遗传进化分析,分析了分离株Nsp2、GP5氨基酸序列的遗传进化关系,并对分离株做了重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,成功分离出1株PRRSV,命名为SH2019,其全基因组开放阅读框大小为14677 bp,分离株与NADC30的核苷酸同源性最高,属于目前流行于中国的类NADC30 PRRSV,其Nsp2存在131个氨基酸缺失的分子特征;分离株是以谱系1毒株为主要亲本,以谱系3、谱系5或谱系8毒株为次要亲本,在12601~12901 nt(ORF2~ORF4)发生了基因重组的重组毒株,分离株不能感染Marc-145细胞。本研究分离鉴定一株重组类NADC30 PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防控提供参考。     

PRRSV变异株ORF5全基因的可溶性表达与重组蛋白的纯化

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株可溶性糖基化囊膜蛋白(GP5),从p MD18-T-ORF5(V)重组质粒中PCR扩增得到PRRSV变异株LX13(1)结构蛋白ORF5全基因编码区,并克隆至原核表达载体p Cold TF DNA上,得到重组表达质粒p Cold-TF-GP5(V),转化大肠埃希菌BL21中诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析。结果表明,目的基因插入位置和阅读框正确,成功表达的融合蛋白分子量约为75.2 ku,并以可溶性蛋白的形式存在,表达量约占菌体总蛋白含量的22.26%。该融合蛋白能与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,说明重组蛋白具有反应原性。该可溶性重组蛋白的获得为研究PRRSV变异株GP5蛋白的抗原性奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征及其病毒变异株的危害控制

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）,又称蓝耳病,是侵害猪繁殖系统和呼吸道的传染病,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。随着PRRSV的变异、疫病的混感和养猪条件的恶化,     

羊口疮病毒疫苗株和野毒株F1L基因的比较分析

羊口疮(Orf)是由羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)引起的人兽共患传染病,ORFV F1L基因编码肝素结合蛋白。为比较分析ORFV疫苗株和野毒株编码的F1L基因的特征,本试验对疫苗株和野毒株的F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学相关软件及方法,对两者的F1L基因在核酸水平和氨基酸水平的变异情况及其二、三级蛋白结构变化情况进行了比较分析。结果显示,此次测定的ORFV疫苗株与野毒株F1L基因核苷酸序列相似性为95.9%,氨基酸序列相似性为94.5%。本研究结果为揭示ORFV异源宿主致弱的机制积累了资料。     

PRRSV SX-1株的分离与NSP2和ORF5基因的克隆及变异分析

从山东莘县恒顺猪场发病猪群中分离到PRRSV病毒（SX—1株）。用RT—PCR法对该分离株的NSP2和ORF5基因进行了扩增和克隆,并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,PRRSVSX-1株的NSP2发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;ORF5基因与JXA1、CH-1a、VR2332核苷酸同源性分别为98．8％、94．9％、88．9％,氨基酸同源性分别为99．0％、93％、87．5％。基因系统发育树分析结果显示,SX-1与JXA1、HUN株的亲缘关系很近,与CH-1a亲缘关系较近,与VR2332、CC-1、RespPRRS／ReproMLV等毒株处于不同分支。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。     

猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

本研究对猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的非结构基因,包括ＯＲＦ１基因、５’端非编码区基因（Ｎｏｎ－ＣｏｄｉｎｇＲｉｇｏｎ,ＮＣＲ）和３’端非编码区基因（ＮＣＲ）分别进行了分子克隆和测序,并对其基因特征作了研究分析。结果表明,ＰＲＲＳＶ－ＣＨ－１ａ株ＯＲＦ１ａ起始密码子上游是由保守序列５’ＵＵＡＡＣＣ３’连接的５’ＮＣＲ,在该区附近的约４３个碱基有较高的保守性,其余核苷酸的变异较大。ＯＲＦ１ａ编码的多聚蛋白又可切割生成六个非结构蛋白（Ｎｓｐ１ａ、Ｎｓｐ１β、Ｎｓｐ２－５）,其中Ｎｓｐ２可能具有型特异性,在不同基因型的ＰＲＲＳＶ分离株之间表现出较大的变异,和ＶＲ２３３２株的ＮｓＰ２的编码基因相比有８６％的同源性,同ＬＶ株只有４５％的同源性;ＯＲＦ１ｂ所编码的聚合蛋白经切割后形成四个非结构蛋白（ＲｄＲｐ、ＣＰ２－４）,同 ＯＲＦ１ａ所编码的蛋白相比较为保守,但是,在ＣＰ４的Ｃ端仍有较大的变异,其编码区和ＶＲ２３３２株相比有８８．７％的同源性,而和ＬＶ株只有５３．４％的同源性。ＣＨ－１ａ株的ＯＲＦ１ａ－ＯＲＦ１ｂ的衔接区为核糖体移码区,在所有的ＰＲＲＳＶ分离株中高度保守,具有保守的５’ＵＵＵＡＡＡＣ３’序列和