鸡空肠弯曲菌的分离鉴定

自哈尔滨地区某疑似空肠弯曲感染鸡场随机取５０份２０周龄蛋鸡新鲜粪便样本，用改良Ｃａｍｐ－ＢＡＰ培养基分离培养，经一系列生化试验鉴定，有１１株分离培养物为空肠弯曲菌，分离率为２２％。     

牦牛空肠弯曲菌的分离鉴定及系统发育分析

采集692份临床健康成年牦牛肛门棉拭子标本,无菌划线接种于改良Skirrow培养基上,根据特征的形态学观察、生化试验和PCR检测方法共分离鉴定出空肠弯曲菌15株,阳性率为2.17%;对其中14株菌进行16 S rRNA克隆、测序,经系统发育分析发现牦牛源菌株组内的同源性为99.5%~100%,与Gen-Bank中其他源菌株的同源性为95.8%~100%,系统发育研究表明,牦牛源空肠弯曲菌菌株与国内鸡、猪源和澳大利亚人源L14630菌株的遗传关系较近,与国外其他人源、牛源、鸡源及黑头鸥源菌株有较远的遗传距离。     

应用PCR技术检测空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的研究

本研究根据空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的16s rRNA基因相同保守序列来设计引物,建立了一种PCR检测方法,该方法具有较强的特异性及灵敏性,其对空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的最低检测限度为5 CFU/mL,它无需增菌培养过程可以直接对样品进行检验,在对鸡肉样品空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的检测中取得了较好的效果.     

空肠弯曲菌致病机理研究进展

空肠弯曲菌病是世界范围广泛流行的人兽共患病,在公共卫生学上具有重要意义。空肠弯曲菌通过鞭毛上的粘附素特异性介导与感染细胞粘附和害居。空肠弯曲菌为革兰氏阴性菌,具有内毒素活性,主要通过ＬＰＳ起作用。ＬＰＳ可诱导多种细胞因子,后者介导内毒素对机体的损伤,引起相应病理变化。     

空肠弯曲菌保存方法的研究

本文研究了１５株不同菌株和同一菌株在不同保存温度和培养基中的保存效果，结果表明：用同一菌株作该菌保存方法研究缺乏整体代表性；在所试的两种冰冻温度中，以－２５℃极显著地优于－１０℃保存（Ｐ＜０．０１）。在－２５℃下冻融１次保存该菌是最佳保存条件，于Ｐ－基、ＦＭＰＧ和ＭＳＧ培养基中，菌株１００％存活的期限分别为１２个月以上、６～９个月间（ＦＭＰＧ和ＭＳＧ），菌株５０％存活的期限三者均在１２个月以上。     

空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立检测血清中空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）抗体的间接ELISA方法,试验通过PCR扩增并克隆空肠弯曲菌PEB1A基因,构建原核表达载体pET32a-PEB1A,将该表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达获得约47 ku的可溶性目的蛋白,通过Western blotting证明所表达的重组蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立空肠弯曲菌抗体间接ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果表明,本试验建立的空肠弯曲菌抗体间接ELISA检测方法临界值为0.3424,本方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与其他抗血清无交叉反应,具有较强的特异性,批内、批间的重复性试验变异系数均<5%,具有较好的重复性和稳定性。该方法的建立可应用于血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测,为进一步防制空肠弯曲菌腹泻提供依据。     

猪空肠弯曲菌感染的防治

猪空肠弯曲菌是一种常见的传染性病原菌,其感染后能够引起猪的严重腹泻和脱水症状,严重时会发生病猪死亡的情况。在猪场时有发生,给养猪场造成严重的经济损失。本文介绍了猪空肠弯曲菌感染的流行病学、临床症状、病理变化和诊断方法,并针对性地提出防治措施,供养猪场参考。     

猪空肠弯曲菌感染的防治

猪空肠弯曲菌感染是在养猪场常见的一种传染性疾病。病猪在发病后表现为严重的腹泻和脱水等症状,严重的病猪会死亡。给养猪场造成严重的经济损失。本文针对本病进行概括和归纳,可供养殖场参考。     

仙台病毒P基因的原核表达及抗原性分析

根据GenBank公布的仙台病毒(SeV)磷蛋白(P)基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增P基因,并将其克隆至原核表达载体pET-32a中;重组质粒经酶切、PCR及测序鉴定正确后.转化感受态细胞BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达,获得相对分子量为99.6 ku的融合蛋白.经western blot及ELISA分析表明表达的融合蛋白具有良好的抗原性.     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻（BVD）鉴别诊断ELISA方法，采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段，分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上，获得了重组质粒pGEX-6PI-p80A、pGEX-6PI-p80B和pGEX-6P1-p80C，将其分别转化感受态茵Rosetta和BL21，经1．0mmol／L的IPTG诱导，分别得到大小为60、47和51ku的目的蛋白。经Western-blotting分析，3个目的蛋白中，只有p80B（289～477aa）基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应，表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

乙型脑炎病毒结构蛋白基因的克隆表达与免疫特性分析

研究分别克隆了乙型脑炎病毒SA14-14-2株的结构蛋白C、PrM/M及E蛋白基因.将3个结构蛋白基因分别插入表达质粒pET30(a)中,成功构建3个原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后利用IPGT诱导,SDS-PAGE分析结果表明,3个结构蛋白获得了表达,表达产物大小与预期一致.Western-blot分析结果表明:表达产物中PrM/M和E蛋白具有很好的免疫反应性,可被抗乙型脑炎病毒血清很好地识别;而C蛋白的免疫反应性较差,不能很好地被乙型脑炎病毒阳性血清识别.该结果提示,乙型脑炎病毒结构蛋白中除E蛋白外PrM/M蛋白也很可能具有诊断抗原的应用潜能.     

马耳他布鲁菌omp25的原核表达与免疫原性检测

为在大肠杆菌中表达马耳他布鲁菌omp25基因并鉴定重组蛋白的抗原性,从马耳他布鲁菌中用聚合酶链反应技术(PCR)扩增得到布鲁菌omp25基因片段,并将目的基因插入原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-omp25转入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western-blot检测表达蛋白。结果显示成功构建了重组质粒pET-32a-omp25,并在大肠杆菌Rosetta中获得了重组蛋白,重组蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应。表明重组质粒pET-32a-omp25可以在大肠杆菌Rosetta中成功表达,并且重组蛋白可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明该重组蛋白有良好的免疫原性,该研究为以后疫苗的研制及布鲁菌病的检测打下良好的基础。     

布鲁氏菌Omp25的表达及抗原性分析

克隆羊外膜蛋白Omp25基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对Omp25蛋白的抗原性进行分析.以布鲁氏菌染色体DNA模板,扩增Omp25基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠杆菌ER2566 (DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blotting鉴定Omp25蛋白的免疫原性.将Omp25克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中.将重组质粒转化于大肠杆菌ER2566 (DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 000的融合蛋白.Western blotting分析表明,所表达的蛋白具有免疫原性.结果表明,成功地表达并纯化了Omp25蛋白,而且纯化的蛋白具有一定的免疫原性.本试验为进一步研究Omp25蛋白的功能以及寻找布鲁氏菌的诊断性蛋白奠定了基础.     

鱼源无乳链球菌透明质酸酶的表达及抗原性分析

透明质酸酶(HylB)是无乳链球菌重要的毒力因子。根据本实验室分离并公布在GenBank上的罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001全基因组序列,PCR扩增获得长为2 346 bp,覆盖hylB保守功能区的基因片段。将该片段采用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化后亚克隆至表达载体pET28a(+),经双酶切、测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行体外原核表达,获得88.5 ku的目的蛋白。将纯化后的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经ELISA和Western blot鉴定该蛋白具有良好的免疫原性。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。     

禽流感H5亚型病毒血凝素基因的表达和抗原性分析

参考已发表的Guangdong/96/1(H5N1)基因序列设计引物,用鸡胚扩增中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存的病毒,收集尿囊液,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因,将PCR产物平端克隆到pMD18-T中,经酶切、PCR及测序鉴定后,定向亚克隆到pET-30a表达载体中。重组子经酶切和测序鉴定为正确后,用IPTG诱导表达,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析重组蛋白的表达情况。重组蛋白r5HA经Ni-NTA His.Bind Resins纯化,并复性,用Western Blotting分析重组蛋白的抗原性。结果表明:表达产物大小约为65 ku,主要存在于包涵体中,表达量约占总蛋白的30%;同时,表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性,可以用作检测H5亚型禽流感病毒抗血清的捕获抗原。     

鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

利用DNAStar分析并筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域,PCR扩增出这两段主要抗原区域并克隆进入载体pMD18-TVector,目的基因经PCR和酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+)。获得的重组质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-bloting及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因克隆、表达及抗原性分析

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。