雌激素处理的奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学分析

雌激素调节多种生理过程,包括乳腺生长发育、形态发生、增殖和分化及乳蛋白的表达。许多磷酸化蛋白调节乳蛋白合成,如磷酸化Stat5和mTOR,但在乳蛋白合成的转录和翻译后水平的调节鲜有报道。为了阐述雌激素在奶牛乳腺上皮细胞中的作用机制,本试验利用双向电泳和质谱分析,鉴定了雌激素调节的细胞核磷酸化蛋白质。在雌激素处理24h后,鉴定出7个表达上调的蛋白质,包括以前报道过的甘氨酰-tRNA合成酶,属于氨基酰-tRNA合成酶家族Ⅱ;这些蛋白质涉及翻译起始因子、GTP结合的核蛋白、热休克蛋白、泛素-蛋白酶体系统。这些筛选出来的蛋白质,揭露了雌激素影响奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质,为进一步研究乳合成的分子机制提供一个新的途径。     

中药王不留行增乳活性单体及催乳素对奶牛乳腺上皮细胞特异性miRNA的影响

本试验旨在研究中药王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞miRNAs表达的影响;荧光定量RT-PCR检测增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素作用后乳腺上皮细胞miRNAs表达变化;王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素均抑制原代培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞miRNA-143、miRNA-125和miRNA-195表达;邻苯二甲酸二丁酯可抑制miRNA-21表达,催乳素对miRNA-21表达的影响尚不确定。首次阐明中药王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯和催乳素能引起乳腺上皮细胞miRNAs表达变化。     

营养素和催乳激素通过哺乳动物雷帕霉素靶点调控乳蛋白的合成

研究结果表明,营养和内分泌系统影响奶牛乳腺内乳蛋白的翻译过程,但其分子机制还不是很清楚。因此,本试验旨在研究营养素和激素通过哺乳动物雷帕霉素(mTOR)信号路径对乳蛋白合成的影响。氨基酸混合物(AA)、能量底物(葡萄糖和醋酸盐)和激素混合物(皮质醇、胰岛素和催乳素)分别或混合添加到培养乳腺腺泡(泌乳奶牛乳腺中分离)的培养媒介中,同时测定乳蛋白合成和mTOR信号路径元件的磷酸化状态。结果表明,AA单独添加时比能量底物或激素混合物单独添加时,乳蛋白的合成提高50%。乳蛋白的合成不受葡萄糖或催乳素的影响。AA能刺激乳蛋白的合成,催乳素同时添加能够进一步增强乳蛋白的合成,但葡萄糖同时添加不能增强这种作用。催乳素能够诱导蛋白激酶B的磷酸化状态,并且AA或葡萄糖同时作为底物时能够增强这种磷酸化状态。AA和催乳素在刺激乳蛋白的合成和进一步提高乳蛋白合成的同时,也提高了mTOR底物(p70核糖体蛋白S6激酶±1、真核起始因子4E(eIF4E)结合蛋白-1(4E-BP1)和4E-BP1的分化异变体)的磷酸化状态。结果暗示营养素和激素可能通过mTOR信号路径调控乳蛋白的合成。     

催乳素对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在探讨催乳素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛BMECs为试验材料,经纯化培养后,培养基中添加不同浓度催乳素[0(对照)、100、300、500和1 000 ng/m L],继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量;采用实时定量PCR法检测乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:1)催乳素浓度为100、300 ng/m L时,BMECs相对增殖率显著高于对照组与其他试验组(P0.05)。2)与对照组相比,300 ng/m L催乳素能够显著提高BM ECs乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、二酰甘油酰基转移酶(DG AT)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因表达量及甘油三酯的含量(P0.05),硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达量有增加的趋势。3)与对照组相比,100、300 ng/m L催乳素能够显著提高哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、催乳素受体(PRLR)基因表达量(P0.05);300 ng/m L催乳素能显著提高αS1酪蛋白(CSN1 S1)基因表达量(P0.05)。综上所述,100~300 ng/m L的催乳素对BM ECs乳脂和乳蛋白合成有较好的促进效果。     

METTL3对乳腺上皮细胞中乳蛋白和乳脂肪合成的影响

本试验旨在研究m⁶A甲基转移酶（methyltransferase-like protein 3,METTL3）在奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMEC）中对乳蛋白和乳脂肪的调节作用。试验建立不同的BMEC模型,应用Western blotting、免疫荧光法检测添加雌激素（E）、蛋氨酸（Met）、METTL3超表达和抑制时对BMEC中乳蛋白和乳脂的影响,以及基因定位和表达变化。结果显示,当在BMEC培养液中添加E、Met及METTL3表达水平提高时,mTOR、p-mTOR、GlyRS、p-GlyRS、CSN2、SREBP-1c等表达量均增加,反之,这些基因表达量均下降,表明METTL3可以通过调控乳脂、乳蛋白的相关信号通路分子的基因表达进而影响乳脂、乳蛋白的表达。提示METTL3是乳合成的重要调节分子,可对细胞中乳脂、乳蛋白的合成起正调控作用。     

小肽调控奶牛乳腺乳蛋白合成的作用机制

小肽作为乳蛋白合成的前体物之一,已证明其具有促进乳蛋白合成的功能,但其调控乳蛋白合成的潜在机制尚未明确。本文主要从小肽对乳蛋白合成的影响、小肽的吸收与降解以及小肽调控乳蛋白合成的机制3个层面,综述小肽调控奶牛乳腺乳蛋白合成的作用机制,以期为奶牛乳蛋白合成的机制研究提供更多的理论依据。     

催乳素对奶牛脂肪细胞脂代谢关键基因的作用

催乳素(prolactin,PRL)是启动和维持泌乳的重要激素,在泌乳期间能调节机体将营养物质和能量优先流向乳腺,用于乳脂和乳蛋白的合成。本试验采用体外分离培养奶牛前脂肪细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞,加入PRL探讨其对脂肪细胞脂代谢相关基因的作用。结果显示,奶牛白色脂肪细胞存在催乳素受体(prolactin receptor,PRLR),且在PRL质量浓度为75μg/L,作用时间为9h时,PRLR表达量达到最高,此时调节脂合成的核转录因子SREBPE-1c及下游控制脂合成的基因FAS和LPL均显著降低,75μg/L组与对照组相比差异极显著(P0.01);控制脂分解的基因HSL显著升高,75μg/L组与对照组相比差异显著(P0.05);细胞培养上清液中的甘油含量显著升高,75μg/L组与对照组相比差异显著(P0.05)。结果表明,PRL能直接作用于奶牛白色脂肪细胞,降低脂合成作用并促进脂分解作用。     

中药饲料添加剂对奶牛内分泌机能的影响

选用党参、白术、黄芪、当归、川芎、益母草、王不留行、木通、甘草等中药组成饲料添加剂,对中国荷斯坦奶牛进行不同剂量的添加试验,测定奶牛血清生长激素、催乳素、甲状腺素和皮质醇含量。结果表明:中草药饲料添加剂可以显著提高奶牛血清甲状腺素、催乳素、生长激素含量,对奶牛血清皮质醇含量影响不大(P>0.05)。中药饲料添加剂的作用与添加剂量有关。     

营养素和催乳激素通过哺乳动物雷帕霉素靶点调控乳蛋白的合成（摘要）

研究结果表明,营养和内分泌系统影响奶牛乳腺内乳蛋白的翻译过程,但其分子机制还不是很清楚。因此,本试验旨在研究营养素和激素通过哺乳动物雷帕霉素（mTOR）信号路径对乳蛋白合成的影响。氨基酸混合物（AA）、能量底物（葡萄糖和醋酸盐）和激素混合物（皮质醇、胰岛素和催乳素）分别或混合添加到培养乳腺腺泡（泌乳奶牛乳腺中分离）的培养媒介中,同时测定乳蛋白合成和mTOR信号路径元件的磷酸化状态。     

中药王不留行对奶牛乳腺细胞增殖及泌乳的影响

为确定中药王不留行对奶牛乳腺细胞泌乳功能的影响,以王不留行为原料,通过水浸提得到王不留行提取液,测出王不留行提取液中增乳活性物质邻苯二甲酸二丁酯含量,设置不同浓度中药提取液进行细胞试验,观察其对细胞泌乳的影响,筛选出增乳效力最显著的药物浓度。结果2 mg/mL(生药浓度)药物组增乳效果最显著,提示中药王不留行可直接作用于奶牛乳腺上皮细胞促进泌乳。     

蛋氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

研究蛋氨酸与乳蛋白合成及乳腺泌乳能力的关系。建立体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型,采用高效液相色谱法、实时荧光定量PCR、细胞活力分析仪、甘油三酯试剂盒检测不同浓度蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L)对体外培养24h的奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响。结果表明,蛋氨酸在1.2mmol/L时对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显,乳糖分泌量最高,β-酪蛋白mRNA表达量最高且甘油三酯合成最多(P<0.01)。     

糖原合成酶激酶3β对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响

本试验通过向纯化的奶牛乳腺上皮细胞中添加不同浓度（0（对照组）、10、20、40 mmol/L）的糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK3β）特异性蛋白抑制剂氯化锂（Licl）,作用细胞24 h,研究其对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响,并利用qRT-PCR和Western blotting分别检测不同浓度Licl对奶牛乳腺上皮细胞中GSK3β、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1） mRNA水平及GSK3β、磷酸化GSK3β （p-GSK3β）、Cyclin D1蛋白水平表达的影响。结果显示,Licl能促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖活性,Licl抑制GSK3β后促进奶牛乳腺上皮细胞增殖的最佳浓度为20 mmol/L。与对照组相比,添加Licl后GSK3β蛋白表达受到抑制,p-GSK3β蛋白表达上调,同时提高了Cyclin D1蛋白表达。表明GSK3β对于奶牛乳腺上皮细胞增殖的能力是负调控因子,失活的GSK3β通过Cyclin D1途径促进细胞周期的进行。     

油酸和硬脂酸对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸结合蛋白3表达和脂滴分泌的影响

为确定外源添加长链脂肪酸油酸和硬脂酸对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸结合蛋白3（FABP3）表达的影响,本试验采用荧光定量RT-PCR检测乳脂合成相关基因的表达情况,确定油酸和硬脂酸的最佳浓度和培养时间分别为75 μmol/L 12 h和100 μmol/L 36 h。采用Western blotting和免疫荧光法检测添加油酸和硬脂酸后FABP3表达和脂滴分泌的情况,为进一步揭示FABP3在乳脂合成信号转导通路中的作用提供理论依据。     

Identification of Suspected Stem/progenitor Cells in Bovine Mammary Epithelial Cells Culture System

To develop the potential function of dairy cow mammary stem cells (DCMECs) in regulation of lactation,we identify putative DCMECs which were BrdU label retaining epithelial cells,at the same time,analysis the location of two new mammary stem cells molecular marks FNDC3B and PROCR to verify the feasibility of them to indicate DCMECs.The mRNA levels of prolactin,growth hormone,insulin-like growth factor-1 and their receptors were detected along with cell passage by Real-time quantitative PCR.The results showed that the proportion of BrdU label-retaining epithelial cells was nearly 0.4% after 25 d continuous culture (passaged 4 times) and few cells were positive for FNDC3B or PROCR.Moreover,we observed the BrdU labelled epithelial cells by asymmetric division.The mRNA levels of prolactin,growth hormone,insulin-like growth factor-Ⅰ and their receptors in primary and passage cells were extremely significant difference(P<0.01).DCMECs would rapidly lose some physiological characteristics and the ability of milk synthesis when not under the condition of induction of lactation differentiation,but a certain percentage of mammary stem/progenitor cells will be retained,whose potential effects on the regulation of lactation and mammary acinar remodeling were worthy of attention.     

中草药添加剂对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能影响

为探讨中草药添加剂对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取3种与泌乳功能相关的中药（甲珠、通草、蒲公英）,应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响。试验结果表明,通草对乳腺上皮细胞泌乳性能影响不显著（P〉0.05）;甲珠和蒲公英对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白和乳糖分泌有显著的促进作用（P〈0.05）,并呈一定的剂量依赖效应,综合考虑确定蒲公英30 mg/mL为其最佳作用浓度。     

牛催乳素基因及其单核苷酸多态性与产奶性状关系的研究进展

SNPs是目前遗传标记研究的一大热点,牛催乳素(prolactin,PRL)基因是与产奶性状相关的重要候选基因。PRL基因上的SNPs与牛的产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率、乳蛋白率等性状存在某种关联,可用于牛的标记辅助选择(MAS)育种。笔者从PRL的结构与功能、基因的定位及作用机制、PRL上的SNPs与产奶性状关系的研究等几个方面进行了综述。     

Comparison of Milk Fat Globule Membrane Proteins in Milk Samples of Dairy Cow and Goat

In order to compare the difference of milk fat globule membrane（MFGM）proteins between dairy cow and goat milk,30 milk samples were collected in a dairy farm and a goat farm from Anhui area,respectively.Extracted proteins from the MFGM-enriched fractions were identified and quantified by LC/MS approach.The results showed that 284 and 334 proteins of MFGM from dairy cow and goat were identified,the biological processes of MFGM proteins were similar between dairy cow and goat which were mainly related to biological regulation,localization,transport,signal transduction and response to stimulus.Meanwhile,there were some differences in molecular functions,and protein binding and nucleotide binding were the most prevalent molecular functions in dairy cow MFGM proteins,while protein binding and structural molecule activity were the most prevalent molecular functions in goat MFGM proteins.And structural molecule activity was the main molecular functions among the difference proteins.Pathway analysis revealed that tight junction,axon guidance,antigen processing and presentation,complement and coagulation cascades were enrichment in dairy cow MFGM proteins,and regulation of actin cytoskeleton was enrichment in goat MFGM proteins.Those results revealed the protein expression pattern difference between MFGM protein of dairy cow and goat milk,and provide reference data for further exploring the molecular mechanism of synthetic milk fat globule.     

牛奶和山羊奶中乳脂球膜蛋白的比较研究

试验旨在分析牛奶与山羊奶中乳脂肪球膜（milk fat globule membrane,MFGM）蛋白组成及潜在的生物学功能。采集牛奶和山羊奶各30份,离心分离牛奶和山羊奶中脂肪,提取MFGM蛋白,液相色谱串联质谱分析结合数据库搜索鉴定,比较了奶牛和山羊MFGM蛋白的差异,分析了MFGM蛋白参与的生物过程、分子功能及相关代谢通路。结果显示,奶牛和山羊MFGM中分别鉴定了284和334个蛋白,奶牛和山羊中蛋白参与的生物学过程的模式非常相似,主要涉及生物调控、定位、转运、信号转导和应激反应等。分子功能方面二者存在一定的差异,奶牛MFGM蛋白主要涉及蛋白结合和核苷酸结合,而山羊MFGM蛋白主要涉及蛋白结合和结构分子活性。奶牛和山羊中差异表达的MFGM蛋白主要涉及结构分子活性。通路分析发现,奶牛和山羊MFGM蛋白涉及的生物学通路稍有差异,其中紧密接头、轴突导向、抗原加工与递呈、补体和凝血级联反应通路在奶牛MFGM蛋白中得到富集,而调节肌动蛋白细胞骨架通路在山羊奶中得到富集。研究结果展示了奶牛和山羊MFGM蛋白的表达模式及差异,为进一步探索两种奶畜乳腺合成脂肪球的分子机制的异同提供科学依据。     

A case of bovine raw milk contamination with Listeria monocytogenes

ABSTRACT: During routine sampling of bulk raw milk on a dairy farm, the pathogenic bacteria Listeria monocytogenes was found to be a contaminant, at numbers < 100 cfu/ml. A strain with an indistinguishable pulsed-field gel electrophoresis pattern was isolated from the bulk milk two months later. Environmental swabs taken at the dairy environment were negative for the presence of L. monocytogenes, indicating a possible case of excretion of the L. monocytogenes directly into the milk. Milk samples were collected from the individual cows and analysed, resulting in the identification of L. monocytogenes excretion (at 280 cfu/ml) from one of the 4 mammary quarters of one dairy cow out of 180. When the infected cow was isolated from the herd, no L. monocytogenes was detected from the remaining herd. The pulsed-field gel electrophoresis pattern of the strain from the individual cow was indistinguishable from that originally isolated from the bulk milk. The infected cow did not show any clinical signs of disease, nor did the appearance of the milk have any physical abnormalities. Antibiotic treatment of the infected mammary quarter was found to be ineffective. This study shows that there can be risks associated with direct contamination of raw milk with L. monocytogenes.