南方红豆杉转录组SSR挖掘及分子标记的研究

 利用Trinity软件对NCBI公共数据库中公布的南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根、茎和叶的转录数据进行转录组的重新拼接。通过对13 737 528条序列组装得到96 279条Unigenes（38 Mb）,通过SSR检测程序从96 279条Unigenes中得到2 160个SSR位点（2.24%）,其平均发生率为1/18.01 kb,基序长度为14 ~ 25 bp之间。优势重复基序为六核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的38.56%和37.08%。2 160个SSR位点由703种重复基序构成,其中六核苷酸占60.96%,主要分布在3 ~ 4重复;二、三核苷酸占总SSR位点的44.81%,其中以（AG/CT）_n、（AT/AT）_n、（AAG/CTT）_n、（AGC/CTG）_n、（AGG/ CCT）_n 和（ATC/ATG）_n重复基序最为丰富,合占总SSR重复类型的34.73%,并出现少量的（CG/CG）_n和（CCG/CGG）_n重复。通过L₉（3⁴）正交试验得到最优的SSR-PCR体系,10 μL PCR体系中含DNA 20 ng,1× PCR缓冲液,MgCl₂ 20 mmol,dNTPs 0.35 mmol,引物0.25 μmol,Taq酶0.45 U。随机挑选62对SSR引物进行8个南方红豆杉株系的SSR扩增,有效扩增率为53.23%,多态性比率为38.71%。这些多态性转录组SSR引物的开发为红豆杉遗传多样性的分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了更丰富的标记。     

利用黄秋葵转录组信息挖掘SSR标记及用于种质分析

通过对黄秋葵（Hibiscus esculentus L.）转录组信息分析,共获得74 600条unigene,全部序列有52 976 011 bp;有3 191条unigene包含SSR的序列,从中鉴定出3 448个SSR位点,其中有235条序列包含1个以上SSR,复合SSR有123个。优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR的60.79%和21.43%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点的11.02%,三核苷酸重复基元以AGA/TCT为主,占总位点的19.61%。利用Primer 3.0共设计出8 088对SSR引物。从87对有效扩增引物中随机选择60对用于32份黄秋葵种质的多态性验证分析,其中36对（占60%）引物表现稳定可重复的多态性。利用UPGMA作图,将32份供试材料分为2类。利用黄秋葵转录组数据进行SSR标记开发,能获得较高频率的SSR位点,且类型丰富,为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更丰富可靠的标记选择。     

菠萝基因组SSR分子标记的开发

实验采用SAM法,以"台农17号"菠萝作为开发基因组SSR分子标记的植物材料,并对开发获得的SSR标记在16个菠萝品种中进行了验证。利用两对锚定引物和12对接头引物筛选菠萝基因组SAM文库,从中开发得到86条含有SSR位点的序列,对这86条序列用MISA软件搜索后得到94个SSR位点,其中单核苷酸重复3个,二核苷酸重复91个。二核苷酸重复仅有2种重复单元,一种是GA/CT,占二核苷酸重复总数的57.14%(52/91),另一种是AC/GT,占二核苷酸重复总数的42.86%(39/91)。研究未发现三核苷酸及以上的重复单元。36对SSR引物对16个材料的扩增结果显示,24对引物能够扩增出清晰、重复性好且符合预期大小的条带,其中13对引物具有多态性,可成为下一步构建菠萝指纹图谱、遗传多样性分析及基因定位等研究中有用的SSR标记。     

韭菜全长转录组SSR信息分析及分子标记开发

利用MISA软件筛选韭菜（Allium tuberosum）全长转录组测序获得的49 876条（大于500 bp）转录本序列（89.44 Mb），共检测出13 111个SSR位点，分布在10 332条转录本中，SSR出现频率为26.29%，平均分布距离为6.82 kb。在搜索的6种SSR位点类型中，1 ~ 3个核苷酸重复类型占主要地位，占总SSR位点数的98.74%，其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复类型分别为66.55%、12.52%、19.67%。发现重复序列的基序有103个，其中二核苷酸和三核苷酸重复类型中出现频率高的基序有AC/GT（2.54%）、CA/TG（2.29%）、GAA/TTC（1.85%）和AAG/CTT（1.60%）。重复序列的长度在10 ~ 289 bp之间，其中小于20 bp的有11 128个（84.88%），大于20 bp的有1 983个（15.12%）。根据这些SSR位点，共设计出3 311对SSR引物，在随机选取的208对引物中有164对（78.85%）能进行有效扩增，其中39对引物在24份韭菜种质资源中表现出多态性。利用多态性引物SSR41，鉴定出‘马蔺韭’ב791’后代中的6株有性生殖后代。以上结果表明，基于韭菜全长转录组测序开发的SSR标记可以为韭菜的遗传多样性分析、种质资源鉴定和有性生殖后代筛选提供充足可靠的标记来源。     

橄榄转录组SSR信息分析及分子标记开发与应用

选取不同品种（系）橄榄成熟果进行转录组测序,结果获得296 314条序列,应用MISA软件进行SSR位点分析,获得86084个SSR位点,分布在70686条序列中,SSR在所检测序列中出现频率为23.86%,其中54735条序列含有两个及以上的SSR位点,占比达68.4%;橄榄转录组中SSR序列以复合型核苷酸、单核苷酸、二核苷酸重复类型为主,三者占SSR总数的88.88%;单核苷酸、二核苷酸重复类型中优势基元分别为A/T、AG/CT/TC/GA。以6个不同橄榄品系（种）为研究对象,对随机挑选的99对SSR引物进行有效性与多态性筛选,最终开发了53个有效性SSR分子标记,12个多态性SSR分子标记。利用开发的12个多态性EST-SSR标记对59份橄榄种质进行多态性评价与群体结构分析,结果共检测到48个多态性位点,香农多样性指数平均0.876,多态信息含量平均0.426。利用混群模型分组、UPGMA聚类和PCA对59份橄榄种质进行群体结构分析,混群模型分析结果与UPGMA聚类结果、主成分分析结果有类群上的交叉,但类群数有所不同,混群模型将其划分为3个类群;UPGMA聚类分析在遗传相似系数为...     

黄皮转录组SSR挖掘及其可用性分析

利用MISA软件筛选黄皮（Clausena lansium）转录组测序获得的68 998条Unigene,共检测出单核苷酸至六核苷酸重复类型的SSR位点11 825个,分布于11 000条Unigene中,出现频率为17.14%,平均分布距离为4.41 kb。6种SSR位点类型中主要为单、二、三个核苷酸重复,分别占总SSR位点的41.48%、24.92%和27.53%。11 825个SSR位点中共发现207种重复基序,重复次数在4 ~ 24次之间,其中出现频率高的基序有A/T、AG/CT、AT/AT、AAG/CTT和AAT/ATT。位点序列长度分布在12 ~ 25 bp之间,其中12 ~ 15 bp最多,占50.95%（6 025个SSR位点）。通过Primer 3设计得到6 102对SSR引物,随机选择30对引物进行多态性验证分析,结果显示24对有效扩增引物中,13对引物在16份不同黄皮种质中表现出多态性。以上结果表明,黄皮转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,开发的大批量SSR标记可为黄皮种质资源遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

印度南瓜转录组SSR信息分析及其多态性研究

对印度南瓜（Cucurbita maxima）开展转录组测序分析,共获得131 960条unigene（90.80 Mb）,筛选得到12 557个SSR位点（占总unigene的9.52%）,其发生频率为1/7.4 kb;其中SSR位点中主导类型为二核苷酸重复,占总SSR的49.82%;其次是三核苷酸重复,其出现频率为45.31%。通过Primer5设计得到7 290对SSR引物,随机选择20对SSR引物对30种不同来源的南瓜进行多态性验证分析,结果显示在14对可扩增产物的SSR引物中,11对引物表现稳定可重复的多态性,UPGMA多态性分析显示11对引物可将30份南瓜材料分为5类。研究表明通过对南瓜转录组分析可获得较高频率的SSR位点且类型丰富,为印度南瓜遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了候选标记。     

辣椒转录组SSR挖掘及其多态性分析

 利用SSR检索程序从两个辣椒转录组共221 037条unigenes（97.3 Mb）中筛选得到17 319个SSR位点（7.83%）,其发生频率为1/56 kb。其中以单核苷重复基序为主导类型,占总SSR的56.30%;其次是二、三核苷酸重复基序,其出现频率分别为19.16%和23.18%。对所有含SSR位点EST序列设计的10 468对引物进行E-PCR多态性检测,获得1 538对E-PCR多态性引物。随机选取20对引物进行验证,其中7对（36.84%）在10个不同类型辣椒材料中表现出多态性,PIC值范围为0.33 ~ 0.89,平均为0.67,将10个辣椒材料分为3类。这些潜在的多态性EST-SSR的开发为辣椒遗传多样性分析、图谱构建提供了更丰富的候选分子标记。     

刺梨转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选刺梨（Rosa roxburghii Tratt）转录组测序获得的106 590条Unigene,共检测出21 711个SSR位点,分布于18 155条Unigene中,出现频率为20.37%,平均分布距离为1.68 kb。优势重复基序为三核苷酸、四核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR位点的26.87%、26.77%和24.93%。AG/CT与AAG/CTT分别是二核苷酸与三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的17.80%和11.55%。以不同主导重复基元类型设计合成42对SSR引物,并以刺梨及其他蔷薇属种质的基因组DNA为模板对其有效性及通用性进行初步验证,筛选出具有清晰扩增产物的引物23对,并且均在同属材料中通用。选取16份贵州刺梨资源对筛选出的引物进行多态性检测,获得12对具有多态性的引物。以上结果表明,刺梨转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为刺梨及其近缘种的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

洋葱转录组SSR信息分析及其多态性研究

采用生物信息学方法分析洋葱（Allium cepa L.）转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列（SSR）引物,以期为洋葱分子标记辅助育种提供有力工具。利用MISA工具筛选了洋葱转录组测序获得的106 932条unigenes（84.04 Mb）,并对其SSR位点信息进行了分析,共筛选得到5 959个SSR位点（占总unigenes的5.10%）,其发生频率为1/14.1 kb。SSRs位点中主导类型是以AAG/CTT（占总SSRs的10.20%）为主的三核苷酸重复,占总SSRs的37.27%;其次是单、二核苷酸重复,其出现频率分别为30.91%和24.75%。利用Primer5共设计出5 258对SSR引物。随机选择20对引物进行PCR扩增,其中12对扩增出清晰可重复的条带,9对在24个不同类型洋葱材料中表现出多态性。利用UPGMA作图,将24个洋葱材料分为4类。     

南方红豆杉4个微卫星位点等位基因变异分析

以南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）的4个微卫星位点为例,通过等位基因长度和序列变异分析,对各位点等位基因的变异特点、变异来源和进化关系进行研究。结果表明：这4个位点在南方红豆杉种内表现出丰富而复杂的变异特点,既有SSR重复区突变形成的等位基因,也有因侧翼序列插入/缺失（Indel）形成的等位基因,还存在同一长度形态的同形异源等位基因（allelic homoplasy）,同时,在1个mtSSR位点中检测到了线粒体基因的异质性（heteroplasmy）。SSR重复序列和侧翼序列突变的共同作用是引起等位基因长度异常的主要原因。等位基因分布及其进化关系研究表明,4个位点的序列突变更符合逐步突变模型（SMM）,常见等位基因在进化上具有原始性。     

菜薹转录组中SSR信息与可用性分析

利用菜薹转录组分析检测到48 975条unigene（38.17 Mb）序列数据,运用MIcroSAtellite（MISA）工具发现其中具有1 ~ 6个核苷酸重复类型的SSR位点11 879个,SSR位点发生频率为1/3.2 kb（312.5/Mb）。6种SSR位点类型中主要为1 ~ 3个核苷酸重复,占总SSR位点数的99.01%,其中单、二和三核苷酸类型分别为41.11%、28.23%和29.67%。发现重复序列的基序58个,重复次数在5 ~ 23之间,其中出现频率高的基序主要有A/T、AG/CT、AT/AT、AC/GT、AAG/CTT和AGG/CCT。重复序列长度在10 ~ 60 bp之间,大多小于20 bp,大于20 bp的仅有7.9%（938个SSR位点）。设计出676对具有潜在多态性的SSR引物组合,从中随机抽取30对引物进行PCR扩增验证其可用性,发现22对引物在4份菜薹种质中的扩增产物条带清晰稳定,其中12对引物具有多态性。     

南方红豆杉种子冷冻催芽试验初报

设置系列冷冻温度和处理时间开展南方红豆杉种子冷冻催芽试验,结果表明:南方红豆杉种子经冷冻处理,于4月份气温升高后播种,约25d种子即可萌发;在-20～-15℃条件下,冷冻处理30d即达最佳效果,其萌发率在75%以上。     

RAPD标记构建芥蓝×甘蓝分子标记连锁图

 以芥蓝C_100-12×甘蓝秋_50-Y7为杂交组合, 构建了F₂ 作图群体, 利用300 个随机引物对两亲本进行了RAPD 检测, 共筛选到150 个RAPD 引物在亲本间表现多态, 多态引物的比率为58. 3 %。共分析了52个引物产生的96 个多态性RAPD 标记在该群体中的遗传。96 个RAPD 标记中有94 个在F2 群体中的分离比符合3∶1 , 说明该群体适合于QTL 分析, 共发现两对共分离的RAPD 标记。利用该作图群体构建了甘蓝的基本遗传图谱。该图谱由9 个主要的连锁图构成, 覆盖基因总长度约为555. 7 cM。     

平欧杂交榛转录组中SSR信息分析和引物筛选

对平欧杂交榛的转录组数据进行了深入挖掘,以期开发其SSRs标记。在25 649条含SSR序列的Unigene中,共找到35 604条SSR序列;其中,单、二、三核苷酸重复为高频类型,其数量及所占百分比分别为：10 102（28.37%）、16 543（46.46%）、7 035（19.76%）;在单核苷酸重复中,A/T重复最多（28.13%）;二核苷酸重复中,AG/CT（35.79%）、AT/AT（7.47%）、AC/GT（3.17%）最为丰富;三、四、五、六核苷酸重复中,比例最高的重复序列分别为：AAG/CTT（7.24%）、AAAG/CTTT（0.33%）、AAAAG/CTTTT（0.38%）、AAAAAG/CTTTTT（0.15%）。依据转录组中的SSRs序列信息,随机合成了60对引物,并对含平榛（Corylus heterophylla Fisch）、平欧杂交榛（C. heterophylla × C. avellana）、欧洲榛（C. avellana）及毛榛（C. mandshurica Maxim.）的25份材料进行了PCR扩增和毛细管电泳,找到7对多态性良好的引物,其PIC（Polymorphism Information Content）值为0.35 ~ 0.70,获得多态性条带52条;UPGMA（Unweighted Pair Group Method Analysis）聚类结果显示,上述引物可将这些种质进行准确区分。以上研究初步明确了平欧杂交榛转录组中SSR的分布特征,为其遗传连锁图谱构建等研究提供了科学依据。     

西南凤尾蕨(Pteris wallichiana Agardh.)发育过程及其孢子的无菌繁殖

研究了西南风尾蕨的发育过程和孢子的无菌培养方法.结果如下:孢子萌发为书带蕨型,配子体发育为水蕨型.1/2MS培养基中萌发率可达83.3%;MS培养基中配子体成苗率可达55.4%;试管苗移栽成活率可达80%以上.认为利用孢子的无菌繁殖方法进行西南凤尾蕨的规模化生产具有可行性.