牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

猪成纤维细胞敲减卵泡抑素基因后的生物信息学分析

在哺乳动物中,卵泡抑素（follistatin,FST）不仅参与生殖调控,还与肌肉生长、脂肪沉积等显著相关。为了探究该基因在成纤维细胞中的生物学功能,本研究利用二代测序技术对敲减FST基因的猪成纤维细胞进行转录组测序,筛选差异表达基因,并利用在线生物学软件对差异基因进行GO功能注释及生物学通路富集分析。结果发现,敲减FST基因后共有370个基因显著上调,287个基因显著下调。与细胞增殖、凋亡相关的HOXA6、PARP14、ZBP1、NDUFB9、RAB13、FAM83D、THBS1和BTF3基因以及与疾病相关的ZNF354C、RNF213、IFIT1、CCL5和VPS13C基因均发生了显著变化。这些差异基因共得到51个GO功能注释,生物过程分类下的生物调节、细胞过程、代谢过程、单一生物过程和细胞组分分类下的细胞器、细胞区域、细胞及分子功能分类下的黏合条目下聚集的差异基因数量最多,均>200个。共发现12条显著富集的通路,包括3条与细胞增殖相关的通路（p53信号通路、细胞周期和真核生物中核糖体的生物发生）,4条与疾病相关的通路（阿尔茨海默氏病、沙门氏菌感染、亨廷顿病和非小细胞肺癌）,2条与肌肉收缩相关的通路（血管平滑肌收缩和心肌收缩）以及泛素介导的蛋白水解作用、肌动蛋白细胞骨架的调节和缝隙连接通路。以上研究结果表明,在成纤维细胞中敲减FST基因后,与细胞增殖分化和部分疾病相关的基因和生物学通路被显著富集,暗示FST基因在成纤维细胞的创伤修复过程中发挥重要的作用。     

沼泽型水牛卵泡抑素基因的真核表达研究

试验通过候选基因法,选定卵泡抑素(follistatin,FS)作为影响水牛繁殖性能的主要候选基因,通过基因工程的方法,用XhoⅠ、SacⅡ双酶切广西大学动物遗传育种与繁殖实验室克隆的添加有ACC的Kozaka 序列的pMD-bFS质粒和pEGFP-N₁,构建pEGFP-bFS真核表达质粒,将其与阳离子脂质体混匀后,分别转染体外培养的水牛胎儿成纤维(BFF)细胞和仓鼠肾(BHK)细胞系,经过48 h培养后,在相差荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达水平,用RT-PCR和Western blotting方法对转入质粒表达进行定性鉴定。结果显示,本研究成功构建了添加有ACC的Kozaka 序列的pEGFP-bFS真核表达质粒,该重组质粒在BFF和HBK两种细胞均表达,但在HBK细胞系的表达量稍高。本研究结果将为下一步制备具有生物活性的bFS工程疫苗,研究bFS对水牛繁殖性能的影响提供参考。     

广西巴马小型猪卵泡抑素的克隆及原核表达

从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA，并以其为模板，应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），在合成的特异性引物引导下，扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素（follistatin）cDNA的全序列，长度为1035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时，将目的基因插入到原核表达载体pET 32a+多克隆位点中，构建了follistatin的原核表达载体，并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析，结果表明：试验已成功表达了follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。     

猪卵泡抑素基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。     

卵泡抑制素基因在猪成纤维细胞中过表达研究

利用piggy Bac转座子将卵泡抑制素(follistatin)基因整合入猪基因组中,检测follistatin基因表达情况及其对细胞分化基因p53和desmin的影响。结果表明:piggy Bac转座子将follistatin基因转座整合入猪基因组中,整合入基因组的位点均为TTAA位点。整合后的follistatin基因可以正常的转录表达,follistatin的过表达引起p53和desmin基因的表达上调。     

促卵泡素对体外培养牛卵泡类固醇合成相关基因表达的影响

本研究旨在探究促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）处理对体外培养的牛有腔卵泡颗粒细胞和膜细胞类固醇激素合成相关基因表达的影响。采集牛卵巢表面直径9~11 mm的有腔卵泡,用含不同浓度FSH的DMEM/F12体外培养牛有腔卵泡24 h。提取卵泡颗粒细胞、膜细胞RNA并反转录成cDNA,利用实时荧光定量PCR检测卵泡颗粒细胞、膜细胞中类固醇激素合成酶基因（CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD）和促性腺激素受体基因（FSHR、LHR）的表达水平。结果显示,FSH处理上调了颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP19A1基因表达,其中,25 ng/mL FSH处理极显著上调了CYP11A1基因表达（P<0.01）,10 ng/mL FSH处理显著上调了3β-HSD基因表达（P<0.05）,50 ng/mL FSH处理显著上调了CYP19A1基因表达（P<0.05）;50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达（P<0.05;P<0.01）,但在10和25 ng/mL FSH处理组中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因表达显著或极显著下调（P<0.05;P<0.01）。对FSHR、LHR基因研究结果显示,不同浓度FSH处理对颗粒细胞中FSHR、LHR基因的表达均无显著影响（P>0.05）,只有25和50 ng/mL FSH处理显著或极显著上调了膜细胞中LHR基因表达水平（P<0.05;P<0.01）,且不同处理组之间膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达变化与LHR基因表达变化趋势较一致。结果表明,FSH处理可提高牛有腔卵泡颗粒细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因的表达,膜细胞中CYP11A1、3β-HSD和CYP17A1基因对LH的刺激更敏感,FSH可能通过影响LHR基因的表达来调节膜细胞中类固醇合成酶基因的表达。     

马立克氏病病毒MEQ基因真核表达载体的构建及对CEF细胞错配修复相关基因表达的影响

MEQ基因是马立克氏病病毒(MOV)血清1型特异性基因,为了研究MEQ基因的致瘤机理,本研究构建了MEQ基因的真核表达载体。首先采用TA克隆将MEQ基因片段连接p MD19-T,构建成p MD19-T-meq,然后采用Eco RⅠ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切将MEQ基因克隆至p VAX-1真核表达质粒,构建p VAX-1-meq真核表达质粒。提取p VAX-1-meq质粒转染至鸡胚成纤维细胞中,转染后提取贴壁细胞中总RNA,以β-actin作为内参采用Real-time PCR检测MEQ基因、错配修复相关基因、p53基因的m RNA表达情况。结果成功构建出p VAX1-meq真核表达载体,并在鸡胚成纤维细胞中成功表达。MEQ基因转染的鸡胚成纤维细胞中错配修复相关基因(MSH2和MLH1基因)、p53基因的m RNA表达量显著上调。表明MDV感染造成宿主DNA损伤后,MEQ基因影响DNA损伤修复相关基因的表达,干扰宿主对损伤的DNA进行修复,导致肿瘤的形成。     

干扰和过表达BAMBI基因对猪卵泡颗粒细胞表型和功能的影响

为研究转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI）基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰（pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3）和过表达（pcDNA3.1-BAMBI）重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5）和细胞凋亡基因（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升（P<0.05）;过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降（P<0.05）;上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡（P<0.01）。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。     

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。     

Cloning and Eukaryotic Expression Plasmid Construction of Porcine Interleukin-18 Gene

To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18.     

太行鸡FST基因克隆、序列特征及表达分析

旨在基于生物信息学方法分析太行鸡卵泡抑素基因（follistatin,FST）,并研究其在不同组织及卵泡不同发育时期表达差异,解析FST对太行鸡产蛋性能的影响。本研究使用RT-PCR对43周龄健康太行鸡FST基因编码区序列进行克隆和测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测,荧光定量PCR技术对43周龄健康麻羽太行鸡FST在不同组织及不同发育时期卵泡中的表达差异进行分析,每组设3个重复,进行3次平行试验。结果显示,太行鸡FST基因编码区为1 032 bp,编码343个氨基酸,太行鸡FST蛋白与日原鸡同源性最高（100.0%）,存在Sec信号肽,成熟蛋白具有FOLN和KAZAL_FS 2个保守结构域。该蛋白为亲水蛋白,蛋白分子式为C₁₆₁₉H₂₅₆₇N₄₅₉O₅₂₀S₄₄,分子量为38.192 6 ku,理论等电点为5.59,其中含量最高的是Cys （C）,为10.50%;蛋白质二级结构含有α-螺旋、延伸链、β转角、无规卷曲,占比分别为16.33%、16.62%、5.25%、61.81%。FST基因在不同组织中均有表达,在肝中表达量最高。FST基因在各级卵泡表达量存在差异,其中,在大白卵泡中表达量最高（P<0.01）,在卵泡选择前后表达量存在1.6倍表达差异。上述结果为研究太行鸡FST基因结构和功能提供了重要的基础数据,也为进一步挖掘太行鸡产蛋性能候选高产基因提供了参考。     

The Expression Comparison Analysis of FST and FMOD Genes in Sheep Fetus during Mid and Late Pregnancy

In order to investigate skeletal muscle development mechanism,the expression of follistatin (FST) and fibromodulin (FMOD) gene were comparatively analyzed in fetus different skeletal muscles and different stages between Ujumqin sheep and Texel sheep during early stage.Two gene expression were analyzed including longissimusdorsi,semimembranosus,semitendinosus quadricepsfemoris and biceps femoris muscle were compared by variance analysis methods of four stages (85,100,120 and 135 d).The results of quantitative Real-time PCR showed that the expression of FST gene showed a tendency to increase with the addition of stage,and the expression of FST gene in Texel sheep was higher than that in Ujumqin sheep in semitendinosus (100,120 d),semimembranosus (120 d),and biceps femoris (120 d) (P<0.05).The expression of FST gene in Texel sheep was extremly higher than that of Ujumqin sheep in semitendinosus (100,135 d),longissimusdorsi (85 d),quadricepsfemoris (100 d) and biceps femoris (100 d) (P<0.01).As a whole,the expression of FMOD gene was the highest in quadriceps femoris,and was lower in other four muscles,it's expression in Ujumqin sheep was higher than that in Texel sheep.It was inferred that FST and FMOD genes might be related to muscle development during early stage.     

FST和FMOD基因在绵羊胎儿妊娠中后期的表达特征比较

本研究以骨骼肌表型差异明显的两个绵羊品种特克塞尔羊和乌珠穆沁羊为试验对象,通过对两个与生长发育相关的基因卵泡抑素(follistatin,FST)与纤维蛋白聚糖基因(fibromodulin,FMOD)在不同日龄、不同骨骼肌部位表达的比较分析,探讨绵羊骨骼肌早期发育规律;同时对绵羊胎儿的85、100、120和135日龄4个阶段,在背最长肌、半腱肌、股四头肌、半膜肌和股二头肌5个部位肌肉FST和FMOD基因的表达量进行了比较研究。实时荧光定量PCR结果表明,随着胎儿日龄的增加,FST基因在半腱肌、股四头肌中表达量有增加的趋势,同时在特克塞尔绵羊中的表达量高于乌珠穆沁羊。在100和120日龄半腱肌、120日龄半膜肌、120日龄股二头肌中FST基因表达量在两个品种间差异显著(P<0.05),在100和135日龄半膜肌、85日龄背最长肌、100日龄股四头肌、100日龄股二头肌中FST基因表达量在两个品种间差异极显著(P<0.01)。FMOD基因在股四头肌中表达量较高,而在其他4种肌肉组织中相对表达量较低,且在乌珠穆沁羊中的表达量高于特克塞尔羊中的表达量。FST和FMOD基因在绵羊早期骨骼肌发育中起着重要作用。     

膜联蛋白B2基因的克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank已登录的猪囊尾蚴膜联蛋白B2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从猪囊尾蚴中扩增出膜联蛋白B2基因,将其克隆至pcDNA3.1表达载体上,经酶切鉴定和基因测序表明,目的基因AnnexinB2已正确地整合至表达质粒中,成功构建了膜联蛋白B2基因的真核表达载体.     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒2b基因的克隆和原核表达

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株2b基因序列,设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从PRRSV中扩增出222 bp的片段,并克隆至pMD18-T,连接到pGEX-4T-1表达载体,将阳性重组质粒pGEX-4T-2b转化到BL21(DE3),对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,所得重组蛋白的分子质量大小为35 ku,与预期结果相同,且具有良好的免疫学活性。