茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。     

木薯转录因子MeERF117的克隆及表达分析

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)类转录因子是植物应答多种逆境胁迫机制中的关键组分,研究木薯AP2/ERF家族成员将有助于解析该家族在木薯抗逆胁迫中的功能。基于已有木薯基因组序列信息,以木薯块根cDNA为模板,克隆得到一段长度为927 bp的cDNA,命名为MeERF117,该基因编码308个氨基酸。MeERF117蛋白分子量为35.08 kD,且该蛋白仅含一个AP2/ERF结构域,属于ERF转录因子家族。在进化关系上,Me ERF117蛋白与巴西橡胶树的ERF蛋白最相近。亚细胞定位观察到MeERF117蛋白分布于细胞质和核中。实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法检测MeERF117基因在木薯块根采后生理性变质(Post-harvest physiological deterioration, PPD)过程中的相对表达量,发现PPD的发生可提高MeERF117因子的表达水平,在PPD后期(48 h)时MeERF117的相对表达量是未发生PPD (0 h)时的2倍,表明木薯块根PPD的发生...     

BvM14-GAI基因的克隆及亚细胞定位

GAI蛋白属于GRAS家族中的DELLA亚家族,参与植物发育、光合、抗逆等重要的植物生长过程。实验室前期在盐胁迫的转录组数据中发现甜菜M14品系GAI基因(BvM14-GAI)受盐胁迫上调表达,为了进行该基因生物学功能的研究,本研究以甜菜M14品系为材料,通过PCR技术获得BvM14-GAI基因cDNA全长序列,并进行生物信息学以及亚细胞定位分析。研究成功获得了BvM14-GAI基因cDNA序列;生物信息学分析显示,BvM14-GAI基因开放阅读框为1824 bp（包括终止密码子）,编码607个氨基酸,理论分子量为66 kDa,等电点为5.37;蛋白多重序列比对和系统进化树分析显示,BvM14-GAI蛋白与菠菜(Spinacia oleracea)和藜麦(Chenopodium quinoa)中GAI蛋白亲缘关系最近;亚细胞定位预测显示定位在细胞核。进一步将BvM14-GAI基因与pCAMIA2300-eYFP载体重组,构建亚细胞定位载体,利用冻融法转化农杆菌EHA105,进行烟草注射,结果显示BvM14-GAI蛋白定位在细胞核。本研究成功获得BvM14-GAI基因的cDNA全长,并确定该基因的烟草亚细胞定位在细胞核中,结果为后续该基因功能的研究提供了重要参考。     

陆地棉耐盐相关基因GhSAMS的克隆及表达

为了挖掘棉花耐盐相关基因,我们根据陆地棉耐盐性抑制消减文库中的一个S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的同源EST设计引物,利用RACE结合RT-PCR技术克隆陆地棉S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA全长,命名为GhSAMS。该cDNA全长1 576 bp,ORF为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSAMS蛋白与拟南芥、盐地碱蓬、水稻中该蛋白的相似性分别为91%、93%和93%。系统发育树结果显示GhSAMS与盐地碱蓬中该蛋白的亲缘关系最近。Real-time PCR分析结果表明,GhSAMS的表达受盐胁迫诱导,在盐敏感材料中诱导被推迟,而且,该基因表达水平在耐盐材料中9835中明显高于在盐敏感材料中S9612中。我们构建了原核表达载体pET28-GhSAMS,经IPTG诱导,实现了GhSAMS在大肠杆菌中的表达,为进一步开展GhSAMS的遗传转化工作奠定了有益基础。     

毛竹PheNAC1基因负调控拟南芥对盐胁迫的耐受性

NAC (NAM, ATAF和CUC)转录因子在植物生长发育、衰老及抵御非生物胁迫等过程中具有重要的作用。为探究NAC基因在毛竹(Phyllostachys edulis)生长发育过程中的功能和响应环境胁迫的分子机制,本研究以毛竹为材料,克隆获得PheNAC1基因的全长CDS序列,并对其序列和表达模式进行分析。结果表明,PheNAC1基因编码区为954 bp,编码318个氨基酸。同源性分析表明,PheNAC1与水稻的OMTN3具有较近的亲缘关系(序列相似性为82.28%)。亚细胞定位结果预测PheNAC1定位在细胞核,转录激活活性分析显示其不具有转录激活活性。PheNAC1基因的启动子区含有胁迫响应元件,如：脱落酸(abscisic acid, ABA)有关的脱水胁迫元件(STRE)、厌氧诱导相关元件(ARE)等,表明其可能参与毛竹的胁迫响应。组织特异性表达分析显示,PheNAC1在毛竹叶中表达丰度最高,根和茎中次之;在成熟叶和衰老叶片中的表达显著高于幼叶。在干旱胁迫和盐胁迫后,分别在1和3 h显著上调表达。在笋采后衰老过程中显著上调表达。过表达PheNAC1基因的拟南芥对盐胁迫的耐受...     

淹水胁迫下‘中山杉406’ThRAP2.1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

ERF(Ethylene responsive factor)转录因子是植物AP2/EREBP转录因子超家族的一个亚家族,广泛参与植物生长发育及各种逆境胁迫反应的调控,ERF亚家族中的第Ⅶ类成员(ERF-Ⅶs)已被证实是调节低氧相关基因表达和响应水淹胁迫的主要转录因子。本研究从中山杉406(Taxodium‘Zhongshanshan 406’)淹水胁迫下获得的转录组数据中,筛选分离出存在显著差异表达的ERF基因,以中山杉406的根为材料,采用RACE技术克隆获得1个ERF-Ⅶ类基因ThRAP2.1(Gen Bank登录号为KY463469)。生物信息学分析表明,ThRAP2.1全长为1 024 bp,包含735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸,无内含子,蛋白质分子量为27.14 kD,等电点为9.30。原生质体的瞬时表达显示:ThRAP2.1蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR显示:ThRAP2.1基因的表达量在中山杉406淹水后产生显著差异,全淹及半淹处理下,ThRAP2.1基因在根中的表达量均显著高于对照,在叶中的表达量均显著低于对照。上述实验结果表明ThRAP2.1参与了中山杉406在水淹胁迫响应中的调控,可作为候选基因用于中山杉及其他落羽杉属树木耐水淹机制的研究。     

海岛棉转录因子EREB5基因的克隆及特征研究

 近年来,ERF (Ethylene-responsive element binding factor) 家族转录因子已成为植物抗逆、抗病的分子机制和作物分子育种研究的热点。本研究以电子克隆、同源扩增和RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术相结合的方法从海岛棉中分离出了一条新的ERF族转录因子基因,命名为EREB5。该基因包含一个573 bp长的开放阅读框,预期编码190 aa长的蛋白质分子。序列分析表明该蛋白除含有一个ERF保守域外,还含有一段核定位信号序列、一段富丝氨酸的激活域、多种磷酸化位点和一个土豆抑制子Ⅰ型家族基序等。构建系统发育树分析表明该因子属于ERF亚家族B3亚组。瞬时表达实验证明该因子定位于细胞核内,同时,凝胶阻滞实验结果说明EREB5蛋白和GCC盒具有较强的结合能力。再者,荧光定量PCR结果表明乙烯和黄萎病菌处理可以诱导该基因的表达。这些结果暗示EREB5蛋白很可能在黄萎病抗性机制中扮演者重要角色。     

小麦TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证

通过RT-PCR从小麦cDNA中扩增获得一个锌指蛋白基因TaCRF2, 该基因的cDNA长度为847 bp, 序列分析表明它编码一个含有280个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为30.97 kD, 等电点为7.03, 且在C-末端含有一个典型的RING-H2型锌指蛋白结构域, 在N-末端含有两个跨膜结构域。氨基酸序列比对发现, TaCRF2与水稻中的一个RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞核和细胞膜上。Real-time PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、盐和ABA的强烈诱导, 低温对该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐性。     

陆地棉SRO基因家族的鉴定及表达分析

SRO是植物特有的类RCD-ONE蛋白家族,在植物抵御各种生物和非生物胁迫过程中具有重要的作用。本研究利用生物信息学方法从陆地棉遗传标准系TM-1(Gossypium hirsutum L.acc.TM-1)基因组中鉴定到12个SRO基因家族成员。多重序列比对及进化树分析表明,12个陆地棉SRO均含有PARP和RST结构域,聚为3类,即A、B和C亚家族。转录组数据分析表明,TM-1全基因组中的Gh_D12G1442在茎中优势表达,Gh_D05G2064在萼片和雄蕊中优势表达;Gh_A05G3788在雄蕊中优势表达,Gh_A12G1318在雄蕊和纤维中优势表达;Gh_A12G2480、Gh_D12G2608、Gh_A05G2257和Gh_D05G2516在纤维中优势表达;Gh_A08G1390、Gh_D08G1685、Gh_A12G2663和Gh_D12G2054具有较为广泛的组织表达。逆境胁迫处理试验表明,Gh_A08G1390明显受冷处理和盐处理的诱导,Gh_D12G2054、Gh_D08G1685、Gh_A12G2663基因在不同的胁迫处理下受到不同程度的诱导。     

棉花转录因子GhWRKY4基因的克隆及特征分析

 本研究从陆地棉中克隆得到GhWRKY4基因,全长cDNA是1281 bp,包含1083 bp的开放阅读框,编码的360个氨基酸属于IIcWRKY转录因子家族。分析GhWRKY4基因结构表明其有三个外显子和两个内含子。GhWRKY4蛋白的亚细胞定位实验表明其定位在洋葱表皮细胞核。实时荧光定量分析结果显示GhWRKY4在棉花的根、茎、叶和花中均有表达。染色体步移得到了GhWRKY4的5’端侧翼序列,生物信息学软件预测表明GhWRKY4包含一系列和胁迫基因调控相关的反式作用元件,表明GhWRKY4参与植物对盐害和冷害胁迫的反应。     

盐胁迫下棉属野生种旱地棉（Gossypium aridum）差异表达基因的cDNA-AFLP分析

 以一个耐盐的二倍体野生种旱地棉和对盐敏感的陆地棉栽培种苏棉12号为材料,运用cDNA-AFLP技术,比较两个材料分别在盐胁迫前后的表达情况,获得了25个仅在旱地棉盐胁迫下特异表达的转录片段（TDF）。将这些片段进行电子克隆,延伸后的序列进行BLAST分析,结果显示23个转录片段推断的氨基酸序列与已知的蛋白同源,这些盐诱导表达的基因主要涉及离子转运、活性氧清除、细胞信号传导、细胞分裂、转录调节、膜保护、渗透调节等功能蛋白。从23个差异表达的转录片段中选择9个进行实时定量PCR（qRT-PCR）分析,结果表明这些基因在盐胁迫后表达显著增强,而且多数在12~24 h达到高峰。这些cDNA克隆是开展棉花耐盐性分子基础研究的重要资源。     

陆地棉REM基因家族全基因组鉴定及表达分析

[目的]REM(Reproductive meristem)基因家族编码一类转录因子在植物生长发育过程中发挥重要作用,但在棉花中未见报道.[方法]基于陆地棉基因组数据和公共数据库中的转录组数据,运用生物信息学方法对陆地棉REM基因家族成员进行系统鉴定,并对该基因家族的理化性质、基因结构、组织表达特异性以及胁迫条件下的表...     

棉花酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因的发掘及在非生物胁迫抗性中的功能鉴定

酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生长发育、响应逆境胁迫及生物膜修复等方面具有重要作用。本研究基于陆地棉(Gossypium hirsutum)遗传标准系TM-1基因组序列信息,鉴定并获得21个棉花ACBP家族基因成员的全序列和染色体定位等信息。聚类分析表明这21个基因分属于I~IV类。依据与拟南芥的同源性,将棉花ACBP家族基因命名为GhACBP1~GhACBP6等6大亚类。转录组分析表明,该家族基因在不同组织、不同发育时期表达差异较大。不同逆境诱导分析表明,GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6显著受盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导,而GhACBP4和GhACBP5对逆境胁迫响应不强烈。进一步分析表明,GhACBP3和GhACBP6的表达受过氧化氢(H2O2)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)的诱导。病毒诱导的基因沉默(VIGS)试验表明,沉默GhACBP3和GhACBP6亚类基因会降低棉花植株对干旱和盐的耐性。目标基因沉默后,植株干物质积累下降,株高变矮,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性降低,丙二醛(MDA)含量升高,表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐盐中发挥作用。研究为利用ACBP家族基因进行棉花抗逆性研究及应用提供参考。     

1个新棉花bHLH类基因GhbHLH130的克隆及表达分析

近年来,已发现碱性/螺旋-环-螺旋(basic/Helix-Loop-Helix,bHLH)类转录因子家族在植物的生长发育调控中发挥重要作用。本研究通过电子克隆方法得到1个新的棉花bHLH类转录因子基因的全长序列,利用反转录-PCR技术从陆地棉中分离出1个bHLH类转录因子基因,并命名为GhbHLH130。该基因包含1个552 bp的开放阅读框,编码184个氨基酸残基。序列分析表明GhbHLH130蛋白包含1个螺旋-环-螺旋(Helix-Loop-Helix)保守结构域,属于bHLH转录因子家族。实时荧光定量分析结果表明GhbHLH130基因的表达受干旱、高盐、低温以及外源脱落酸的显著诱导。亚细胞定位结果表明GhbHLH130基因在细胞核内表达。本研究结果表明GhbHLH130基因可能作为调控基因参与棉花的逆境应答响应过程。