菊属ISSR反应体系的建立及优化

以菊属野生种和不同类型菊花品种为试验材料,通过正交试验对菊属ISSR-PCR反应体系进行初选,在此基础上对体系中的dNTP、引物、Mg2 、TaqDNA聚合酶、模板DNA等最佳浓度进行了筛选,通过稳定性检测,优化了菊花ISSR-PCR反应体系:总体积20μl,DNA模板量60 ng;引物浓度0.5μmol/L;dNTP浓度100μmol/L;Mg2 浓度1.875 mmol/L;Taq聚合酶1 U。     

长春花ISSR-PCR 反应体系的正交优化

[目的]筛选最适的长春花ISSR-PCR反应体系。[方法]采用正交试验方法,对影响长春花ISSR-PCR反应体系的引物浓度、dNTP浓度、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶浓度和模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行正交试验,建立适合长春花ISSR-PCR的反应体系。[结果]长春花ISSR-PCR反应体系的最佳条件：引物浓度0.50μmol/L,dNTP浓度0.10 mmol/L,Mg2＋浓度3.00 mmol/L,Taq酶浓度0.75U/25μl,DNA模板浓度350 ng/25μl。采用该反应体系筛选出12对适合于长春花ISSR-PCR反应的引物。[结论]利用优化系统进行长春花的ISSR-PCR反应,可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果。     

槭属树种ISSR-PCR反应体系的确立

采用改良CTAB法提取槭属树种总DNA,分析了Taq聚合酶、样本浓度、Mg2 浓度、dNTP浓度以及引物浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响,用四因素三水平正交法确定了Taq酶浓度、引物浓度、Mg2 浓度、dNTP浓度的最佳组合,并优化模板浓度,建立了稳定、可重复的槭属树种ISSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数.ISSR-PCR的最佳反应体系为:在10 μL的反应体系内,Taq聚合酶宜加入0.25 U,dNTP最适浓度为0.3mmol/L,模板最适浓度为4 ng/μL,引物最适浓度均为0.5 μmol/L,不同的引物有其各自合适的Mg2 浓度.槭属树种ISSR-PCR引物筛选及反应体系的建立,为利用ISSR标记技术开展槭属树种的系统进化和亲缘关系研究提供一个强有力的工具.     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

正交设计优化棉花黄萎病菌ISSR-PCR反应体系

采用正交试验设计方法,对ISSR的影响因素进行研究,从Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平进行优化试验,筛选并建立了适合棉花黄萎病菌的ISSR-PCR最佳反应体系,即25 μL的反应体系中含有1×PCR buff-er,00 μmol/L dNTP,.75 μmol/L引物,50 mmol/L Mg2+,U TaqDNA聚合酶和40 ng模板DNA.     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

雷公藤ISSR反应体系的建立与优化

[目的]建立适合雷公藤的ISSR-PCR反应体系,为雷公藤种质资源的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析提供技术支持.[方法]采用单因素试验设计优化影响雷公藤ISSR-PCR扩增效果的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物浓度和DNA模板含量及退火温度,并以32份雷公藤样品对优化的ISSR-PCR反应体系进行验证.[结果]优化的雷公藤种质资源ISSR-PCR反应体系为:20.00μL反应液中含1.50 U Taq DNA聚合酶、0.30 mmol/L dNTPs、2.00 mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、20 ng DNA模板和2.00μL 10×Buffer.ISSR-PCR扩增程序中最佳退火温度为54.7℃.[结论]建立优化的雷公藤ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性、重现性和适用性,可应用于雷公藤不同地理种源间的遗传多样性鉴定.     

正交设计优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系

[目的]优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考.[方法]利用正交试验设计对大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA)4水平进行优化分析,并在此基础上对PCR反应过程中的退火温度进行筛选.[结果]建立了大旗瓣凤仙ISSR-PCR的优化反应体系,即在25.0 μL反应体系中含1×PCR Buffer、Mg+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、TaqDNA聚合酶0.75~1.00 U、模板DNA 100 ng.通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物.[结论]优化的ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的ISSR遗传多样性分析.     

正交设计优化油松ISSR-PCR反应体系

采用正交设计的方法对油松ISSR-PCR反应体系5因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS数据软件分析。结果表明:各因素不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,且除dNTP因素外其他4因素影响均较大;筛选出各反应因素的最佳水平,建立油松ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq DNA聚合酶1 U、模板5μg/μL、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、引物0.4μmol/L;进行梯度退火试验,筛选出针对不同引物的最适的油松ISSR退火温度。该优化体系的建立为油松及其近缘种的系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

适于长竹蛏的ISSR反应体系的优化

[目的]以长竹蛏基因组DNA为模板,探讨利用简单重复序列区间分子标记技术进行PCR扩增的最优条件。[方法]采用单因素比较试验,分析了Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响。[结果]长竹蛏的ISSR反应体系包括10×Buffer,2.5 mmol/LMg2+,0.25 mmol/L dNTP,0.5μmol/L ISSR引物,0.040 U/μlTaqDNA聚合酶,1.6 ng/μl模板DNA。[结论]优化后的反应体系适于长竹蛏的ISSR-PCR扩增。     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。     

适用于川芎的ISSR-PCR反应体系的建立及优化

[目的]建立和优化适合川芎的ISSR-PCR反应体系。[方法]以川芎叶片为材料,利用改良CTAB法提取了叶片基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR反应的影响,对适合川芎的ISSR-PCR反应条件进行了优化。[结果]适合川芎的ISSR-PCR反应体系为25.0μl,其中含2.5μl 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、2.1 mmol/LMgC l2、300μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、1.0 UTaqDNA聚合酶和20～40 ng模板DNA。[结论]为进一步对全国17个不同分布区的川芎资源进行遗传多样性研究奠定了基础。     

珍稀濒危植物银缕梅ISSR-PCR反应体系建立及优化

[目的]建立和优化银缕梅ISSR-PCR反应体系。[方法]采用正交试验和单因子试验对影响PCR扩增体系中的Mg~(2+)浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶用量5个因子进行分析研究。[结果]银缕梅ISSR-PCR 25μL反应体系中5个因子最优水平:DNA模板(20 ng/μL)2.50μL,引物(10μmol/L)1.00μL,Taq酶(5 U/μL)0.10μL,Mg~(2+)(25 mmol/L)3.00μL,d NTPs(2.5 mmol/L)1.50μL。[结论]银缕梅ISSR-PCR反应最优体系的建立为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子指纹图谱构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。     

温郁金ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

[目的]寻找一个可用于温郁金ISSR-PCR的最适宜反应体系。[方法]利用CTAB法提取基因组DNA,同时利用PCR扩增技术和方法,对引物、模板DNA、Mg2+d、NTP、Taq聚合酶等反应条件进行优化。[结果]反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2+浓度(25mmol/L)2.2μl,Taq聚合酶(5 U/μl)0.4μl,引物浓度(20μmol/L)1.5μl,模板DNA(5 ng/μl)1.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2.2μl,10×PCRbuffer2.5μl;PCR扩增程序为:1个循环的94℃预变性5 min;94℃变性35 s,相对应的引物退火温度退火1 min,72℃复性1.5 min,共36个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]该体系是适合温郁金ISSR-PCR反应的最适宜体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带清晰而稳定等特点,为今后温郁金遗传多样性的研究奠定了基础。     

野生大麦ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

利用SPSS建立正交试验体系,从Taq酶、Mg2+离子、dNTP、模板、引物的浓度5个水平对大麦ISSR反应体系进行优化,确定了适合大麦的快速高效ISSR反应体系。试验结果表明,在25μl反应体系中各反应成分为:0.5 U Taq酶,1μmol/L Mg2+,0.2μmol/LdNTP,0.3μmol/L引物,50 ng模板DNA。这一反应体系的建立对利用ISSR-PCR进行大麦种质资源的分类和新基因资源的挖掘打下了坚实的基础。     

松江鲈鱼ISSR-PCR反应体系的建立及优化研究

[目的]建立及优化松江鲈鱼ISSR-PCR的反应体系。[方法]采用ISSR-63引物,通过正交试验设计,分别对TaqDNA聚合酶、Mg2+d、NTPs和引物浓度等4种PCR原料进行优化,以确立松江鲈鱼的ISSR-PCR反应最佳体系,并通过温度梯度PCR,筛选适宜的退火温度。[结果]确定了松江鲈鱼的最适ISSR-PCR反应体系,20μl反应体系中含2.5 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTPs,0.25μmol/L引物,1.0UTaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板及1×PCR buffer,确立退火温度为50.8℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生松江鲈鱼样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带。[结论]该研究为松江鲈鱼的遗传多样性分析及种质资源研究奠定了一定的基础。     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

桑叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化桑叶稳定的ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法对最适因素水平进行筛选。[结果]适用于桑叶的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:dNTPs 0.35 mmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶1.25 U、引物0.4μmol/L、DNA 100 ng。[结论]对于桑叶ISSR-PCR试验,一次正交试验基本可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。