不含 SBTI-A_2的基因导入我国大豆的遗传表达

大豆 Glycine max(L.)Merrill 种子中的主要营养抑制因子是 Kunitz 胰蛋白酶抑制剂(SBTI—A_2)。经利用标准 SBTI 比较谱带的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析方法,证实了我国栽培大豆中豆19、临沂81-551、通县元豆、中作84-C_(42)和中作84-C_(02)均属 Ti~aTi~a 型。并利用上述5个黄淮海夏大豆品种或品系与美国不含 SBTI-A_2(titi)品系 L_(81-4590)和 L_(83-4387)杂交,在7个组合的 F_2代中得到了 titi 型。其表型比例为3∶1,符合孟德尔单基因遗传规律。进一步的研究正在进行中。     

抗玉米螟基因Cry1A.301原核表达和玉米遗传转化

增强玉米品种的抗虫性是减少玉米螟为害、提高玉米产量的有效途径。通过密码子优化改造获得抗虫基因Cry1A.301,构建原核表达载体pET30a-Cry1A.301,进行蛋白免疫学、ELISA检测以及玉米螟抗性生测。结果表明,原核表达载体中Cry1A.301蛋白高效表达,且7d后杀虫效率达100%。通过Cry1A.301基因与植物表达载体CPB连接,构建CPB-35S∶∶Cry1A.301-35S∶∶bar载体进行农杆菌介导的玉米萌动胚遗传转化,得到12株T0代转基因植株。T0代植株叶片中目的基因、筛选标记bar基因的PCR检测与蛋白免疫学检测结果表明,Cry1A.301基因已经整合到玉米基因组并表达。     

抗病基因PR1在大豆中的遗传转化与多抗材料的培育

单一抗病、抗虫品种在农业生产中已经不能满足需要,本研究通过基因工程技术构建抗病基因pCAMBIA-3301-PR1表达载体,通过花粉管通道法转化外源抗病基因PR1到含有CryAB-13-1转基因高世代受体大豆中,得到兼具抗病抗虫新材料。对T2转基因植株进行常规PCR检测,Southern Blot杂交,Real Time PCR检测,室内、室外抗虫鉴定,室内抗病鉴定。结果表明,在T2代常规PCR检测中,阳性植株共15株。Southern Blot杂交结果显示,PR1与CryAB-13-1基因均以单拷贝子的形式整合在大豆中。Real Time PCR表明PR1和CryAB-13-1基因在不同组织中表达量有差异,PR1基因在植物根、茎、叶中表达量平均分别为2.88、1.48、5.86,CryAB-13-1基因在根、茎、叶中表达量平均分别为3.03、1.32、7.11。室外抗虫鉴定阳性植株CryAB-13-1基因的植株虫食率为3.47%,抗虫级别上属于R-抗,抗虫级别从感虫到抗虫级别。室内采用圆盘分隔法进行抗虫鉴定,转化植株芽长有明显增长。室内抗病鉴定未转化植株平均死亡率高达58.34%,转...     

基于FAE1和FAD2基因的油菜种子脂肪酸生物合成遗传调控

脂肪酸延伸酶1基因FAE1和Δ~(12)-脂肪酸脱饱和酶基因FAD2是植物脂肪酸生物合成途径中的两个关键酶基因,在同一甘蓝型油菜品种CY2中对这两个关键酶基因进行单表达和双表达遗传调控获得五种不同类型的具有相同遗传背景的转基因株系。本研究分析比较了种植于相同环境条件下的五类转基因株系及野生型对照的种子脂肪酸组成和含油量,结果表明,两基因单独和双重调控可显著改变油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸和芥酸等多种脂肪酸含量,其中两个内源目标基因同时沉默种子中的油酸含量从20.5%提高到了82.8%,拟南芥FAE1基因籽粒特异表达种子中的芥酸含量由43.9%增加到了60.2%。与野生型对照相比,五类转基因种子中的十八碳不饱和脂肪酸相对比率和油酸脱饱和比例均发生了显著变化。此外,增强FAE1基因表达后种子含油量有所提高,而沉默两个目标基因的表达则使种子含油量降低,表明两个关键酶基因调控对油脂合成与积累也产生一定影响。     

基因枪法对大豆进行CpTI基因的遗传转化

以大豆品种合丰25的球形期体细胞胚为受体,以CpTI基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,同时以抗性体细胞胚筛选率作为转化率的指标,对影响基因枪转化的几个参数进行了优化研究。结果表明,氯化钙浓度2.5 mol/L、氦气压力1 100 Psi、轰击次数为2次,有利于提高转化率;经卡那霉素筛选得到抗性植株,经PCR分析鉴定有2株为阳性,初步证明外源基因CpTI已转到大豆基因组内。     

O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒的构建及其在BHK-21细胞中的表达

为了构建O型FMDV P1-2A基因与猪IFN-γ基因共表达质粒并在BHK-21细胞中进行表达,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)从阳性质粒pGEM-P12A克隆到P1-2A基因,将扩增产物纯化、双酶切后连接到pBudCE-IFN载体,构建重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A.重组表达质粒鉴定后,在脂质体介导下转染BHK-21细胞,用RT-PCR和直接免疫荧光试验分别检测P1-2A 和IFN-γ在BHK-21细胞中的表达.RT-PCR检测显示,重组表达质粒转染细胞后P1-2A 和IFN-γ基因成功转录出mRNA;免疫荧光试验表明目的基因在BHK-21细胞中获得了表达.结果证明,本研究成功构建了重组质粒pBudCE-IFN-P1-2A并在体外进行了表达,这为研制抗FMDV DNA疫苗和IFN-γ的佐剂作用奠定了坚实基础.     

大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和lh时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因...     

Pd2和Lf2位点定义大豆连锁群16

尽管在构建大豆的分子图谱方面已经取得了进展，但是许多基因仍定位在经典图谱上。为了促进经典遗传图谱的构建进行了本文所报道的遗传连锁研究。在MD的Beltsville的大田，采用亲本T41、T255、T264、BV12、BV18和BV20进行所有杂交组配。BV12是     

大豆FAD2-1b 基因沉默载体的构建

旨在培育生物安全的转基因大豆。设计引物、采用RT-PCR从高蛋白大豆品种‘黑农35’中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆‘黑农37’中克隆FAD2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆品种中克隆FAD2-1b基因片段,作为正向臂和反向臂。连接这些目的片段,构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为FAD2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,扩增得到的重组质粒经酶切和序列分析鉴定正确,命名为pDT-FAD2I。本研究构建了针对大豆FAD2-1b基因的沉默载体,为进一步获得FAD2-1b基因沉默大豆,培育转基因安全的高品质大豆奠定了基础。     

与CX1834—1—2大豆种子植酸含量有关的位点的遗传作图分析

低植酸品种的培育已成为大豆育种的重要目标。植酸盐是大豆种子磷（P）的主要存在形式，其中有67～77％的磷是以植酸的形式存在的。植酸磷对家禽、猪、人等单胃动物是不能利用的。另外，植酸与钾、镁、铁、磷、钙等阳离子结合，降低了其营养利用价值。     

植酸酶phyA基因的密码子优化及其在大豆中的表达

植酸是植物源食品中的主要抗营养成分, 降低植酸含量可有效提高大豆的营养利用率。本文根据大豆密码子使用偏好性, 对无花果曲霉植酸酶phyA基因进行密码子优化, 人工合成了适合在大豆中表达的phyA(b)基因。以pCAMBIA3301为骨架, 构建由大豆凝集素基因启动子和信号肽序列调控的植物表达载体pCBPS-phyA(b)。用农杆菌介导法遗传转化吉林35大豆子叶节。PCR检测表明目的基因已初步整合至大豆基因组中; bar试纸条表明所有阳性植株中均能检测到bar基因的蛋白产物; 除草剂叶片涂抹显示野生型的叶片出现黄化或枯萎现象, 而转基因植株叶片表现正常, 具除草剂抗性; 以半定量RT-PCR共筛选到13株转phyA和19株转phyA(b)阳性转基因大豆植株。通过对转基因大豆T3种子中植酸酶活性、无机磷和植酸磷含量等检测, 证明人工基因phyA(b)比phyA在大豆种子中所表达的植酸酶具有更高的活性, 说明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

离子束辅助大豆基因群导入小麦的研究

用低能离子束辅助,将大豆全DNA分别导入中育5号、淮阴9628两个小麦品种,获得高蛋白(>18 5%)单株5株,最高株蛋白质含量为21 44%;低蛋白(<11 5%)单株3株,最低株蛋白质含量为10 96%。研究结果还表明,不同小麦受体基因型的转化效率明显不同。     

大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达GmGS1β2基因功能的初步分析

从Phytozome数据库中获得包括大豆在内的12种植物的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)氨基酸序列,利用MEGA5.10软件进行多序列比对、构建进化树。进化分析表明,植物GS可以分成胞质型(GS1)和质体型(GS2)两大类,GS1可进一步分成分5个亚类,包括双子叶植物为主的I、II和III亚类、低等植物类(IV)和单子叶植物类(V)。这5亚类中,第II类是豆科植物特有的一类,大豆的4个GS1 (GmGS1β1/2和GmGS1γ1/2)属于该亚类;利用qPCR在大豆盛花期分析GS1基因的组织表达特异性,结果表明不同类型GmGS1基因在表达部位和表达丰度上存在较大差异,而同一类基因之间具有相似的表达规律;4个豆科植物特有的GS1基因在大豆根瘤中都有较高的表达量,其中位于大豆第18染色体上的GmGS1β2基因表达丰度最高;利用原核表达系统体外表达GmGS1β2蛋白,诱导出分子量大小与理论预测值一致的目标蛋白,酶活性分析表明GmGS1β2可以与底物发生催化反应,具有谷氨酰胺合成酶活性,推测该基因在大豆根瘤氮素同化代谢中具有重要作用。     

转基因小麦外源品质基因1Dx5表达的遗传研究

转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达量是内源相应基因表达量的6倍。利用小麦转基因品系为父本，常规品种鄂麦12、鄂麦18和日喀则8号分别为母本，配置3个杂交组合。采用SDS—PAGE技术，检测各组合亲本、F1、F2代的HMW-GS组成，研究转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达的遗传。结果表明：外源1Dx5基因有功能拷贝整合在1个位点，如同内源品质基因，遵从孟德尔遗传模式。这对育种选择策略的制订具有指导意义，也表明了基因枪转化法能够使得外源基因有功能拷贝整合在1个位点并能稳定传递。