鹅肌球蛋白重链1基因MyHC1全长cDNA克隆、序列及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是组成肌原纤维粗丝的主要成分,在肌肉生长发育和运动收缩过程起重要作用。本研究采用反转录PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA ends,RACE)方法,从太湖鹅(Anser anser)肌肉中克隆到肌球蛋白重链1基因(myosin heavy chain 1,MyHC1)的全长cDNA,并运用生物信息学的方法对其进行分析,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测MyHC1基因在鹅胚胎期的表达情况。研究结果表明,鹅MyHC1基因(Gen Bank登录号:KM675469)cDNA全长6028 bp,包含5 823 bp的开放性阅读框,57 bp的5’端非编码区和148 bp的3’端非编码区,共编码1 940个氨基酸。经预测,鹅MyHC1基因编码的蛋白质由31 478个原子组成,分子式为C9746H15817N2753O3096S66,相对分子质量为223 kD,等电点为5.62,平均亲水性为-0.786,属于不稳定亲水蛋白。在线预测鹅和鸡(Gallus gallus)的MyHC1蛋白质三维结构呈高度相似,由多螺旋和折叠片聚集成球状头部,并带有长纤维状α-螺旋尾部。鹅MyHC1的编码区(coding sequence,CDS)序列与鸡的同源性最高,为92.86%,与哺乳类同源性多数在84%左右,与两栖类同源性相对较低。鹅与鸡氨基酸同源性最高,为96.45%,与哺乳类的同源性多数在90%左右,与非洲爪蛙(Xenopus laevis)同源性较低,为78.13%。系统进化树分析表明,哺乳动物形成一个大分支,两栖类自成一支,鹅和红原鸡聚成一支,分子进化地位的关系最近,验证了鹅和鸡属于近缘物种。qRT-PCR检测到MyHC1基因在胚胎期第7天开始表达,以后表达量逐渐升高,在15d表达量达到高峰后下降,25d之后逐渐趋于平稳,表明,MyHC1基因在鹅胚胎期mRNA水平的表达量呈先上升再下降的趋势。本研究首次获得了鹅MyHC1的全长cDNA序列、分子的结构特点和表达特征,显示该基因在鹅肌肉生长发育过程起重要作用,为该基因的功能及鹅肉质性状研究提供了基础资料。     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达研究

根据Genbank上发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了由2个外显子和1个内含子组成的鹅脂联素基因。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3 Da、5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏、肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾、肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢、间脑中低度表达。本试验结果为进一步研究脂联素的功能及作用机制奠定了基础。     

朗德鹅3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)cDNA克隆及其mRNA在填饲鹅肝组织中表达的研究

本实验旨在获得鹅(Anser anser)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(HMGCS1)的cDNA序列,观察该基因的表达与填饲鹅肝脏生成胆固醇的相关性。选用填饲28 d朗德鹅作为实验材料,运用RACE方法扩增目的基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR技术检测并分析HMGCS1基因在各组织中mRNA的表达,比较填饲28 d后各组织HMGCS1基因表达的变化,同时选用胆固醇试剂盒测定鹅肝中胆固醇的含量。结果显示,HMGCS1基因的cDNA全长为2 947 bp,开放阅读框编码522个氨基酸(GenBank登录号:KF425515)。荧光定量PCR结果显示,该基因在肝脏中表达显著高于其他组织(P0.05)。填饲28 d后,填饲组肝脏胆固醇含量低于对照组(P0.05),该基因在肝脏中的表达显著降低(P0.05)。氨基酸序列分析表明,HMGCS1基因高度保守,与鸭(Anas platyrhynchos)、鸡(Gallus gallus)、鸽子(Columba livia)等家禽同源性较高。该基因特异性地在肝组织中表达,且该基因的表达与肝脏中胆固醇合成呈正相关。本实验结果为进一步研究HMGCS1基因的功能提供了参考资料。     

鹅生长激素基因的克隆和组织表达

根据鸡的生长激素基因(GH)序列设计引物对鹅总RNA进行RT-PCR反应，将扩增片段进行克隆和测序。结果获得了包括从ATG开头到TGA结尾的651bp的鹅GH基因编码区序列。鹅与鸡的GH基因的编码区高度保守，同源性达92％，演译成氨基酸后同源性达96％；与人和鼠GH基因编码区序列同源性分别为63．81％和74．31％，演绎成氨基酸后同源性分别为52．51％和72．81％。同时用RT-PCR和Northern-blot对鹅12种组织表达差异分析表明鹅GH基因只在垂体和下丘脑中表达。在心脏、肺、肝脏、小肠、胃、腿肌、脾、肾脏、脂肪和睾丸中都不表达。     

填饲对朗德鹅SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化和mRNA表达的影响

DNA甲基化是表观遗传学的研究热点之一.为了探索填饲是否能够引起朗德鹅Anser anser)肝脏脂类代谢中DNA甲基化水平以及基因表达量的变化和DNA甲基化修饰作用和基因表达之间的关系.本研究运用焦磷酸测序技术分析鹅肝脏硬脂酞辅酶A去饱和酶5基因(stearovl-CoA desaturase 5,SCD5)、固醇调节元件结合蛋白2基因(sterol regulatory element-binding protein 2,SREBP2)和超长链脂肪酸延伸酶6基因(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)的甲基化水平,再运用qRT-PCR技术进行定量验证.结果显示,SCD5、SREBP2和ELOVL6各2个片段的甲基化水平均在20％以上,均属于高甲基化状态;对照组3个基因各2个片段的甲基化水平均高于填饲组,填饲组与对照组的SCD5-1S和SREBP2-1S片段甲基化差异显著(P＜0.05),SREBP2-2S片段甲基化差异极显著(P＜0.01),SCD5-2S、ELOVL6-1S和ELOLV6-2S片段甲基化差异不显著(P＞0.05);填饲组SCD5和ELOVL6的mRNA表达量均高于对照组,而SREBP2在填饲组的mRNA表达量显著低于对照组(P＜0.05).综合各项指标,填饲引起鹅肝脏组织SCD5、SREBP2和ELOVL6甲基化水平降低,SCD5和ELOVL6 mRNA表达量上升,SREBP2的mRNA表达量降低,表明SCD5和ELOVL6的甲基化修饰对mRNA的表达起反向调控的作用.本实验结果为表观遗传学上DNA甲基化研究方法提供参考,为选育鹅肥肝高产高质系提供重要的分子遗传学依据,也为人类肥胖症和脂肪肝等代谢疾病的研究提供理论依据.     

青花菜花粉外壁蛋白基因的克隆与表达特征分析

花粉外壁蛋白参与多种植物生理进程,在花粉发育过程中起着重要的作用。本试验以青花菜保持系‘WN12-95B’为材料,利用RT-PCR技术克隆得到青花菜花粉外壁蛋白（PCP）基因。结果显示,该基因全长578 bp其中开放阅读框长度为561 bp共编码186个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,在第1~24位有一个信号肽序列,预测相对分子量为18.82 kD等电点为10.91。青花菜PCP蛋白的二级结构主要由a-螺旋和不规则卷曲构成,不含β-转角。系统进化分析表明青花菜花粉外壁蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与甘蓝进化关系最近。采用qRT-PCR技术分析青花菜PCP基因的表达特性,结果显示该基因仅在花蕾中表达,具有明显的组织特异性。青花菜Ogu不育系及其保持系不同发育阶段花蕾中PCP基因差异明显,表明其在花粉发育中具有重要的作用。本研究结果为进一步研究PCP基因在青花菜花粉发育过程中的作用奠定基础。     

SYBR Green I荧光定量PCR法检测朗德鹅填饲前后黑素皮质素受体-4基因(MC4R)的表达

黑素皮质素受体4基因(MC4R)在各组织中的不同表达对于鹅脂肪代谢具有重要作用.本研究应用强制填饲技术建立腹型肥胖朗德鹅(Casuarius casuarius)模型,提取填饲后及正常朗德鹅新鲜腹脂、肝脏等13种组织的总RNA,SYBR GreenI荧光定量PCR法检测各组织MC4R基因的表达,选择β-actin作为内参基因,使用半定量2-△△Ct法分析.PCR结果显示,MC4R基因及β-actin在填饲前后朗德鹅心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌胃、小肠、胰腺、脑、胸肌、腿肌、腹脂、皮下脂等13种组织中均存在不同程度表达.SYBR Green I荧光定量PCR结果表明,在肾、小肠和心这3个组织中,填饲后朗德鹅MC4R表达量均比对照组中朗德鹅该基因表达量低,填饲后分别为填饲前表达量的0.41±1.80、0.65±5.75和0.72±1.22倍.而在其他组织中,MC4R基因表达量均有不同程度的增加,填饲组/对照组相对表达量倍数由高到低顺序分别为:22.78±1.00倍(脑),9.08±2.80倍(肝),5.28±1.83倍(肺),3.78±3.01倍(胰),3.07±3.64倍(腿肌),2.90±0.97倍(胃),2.34±1.66倍(皮下脂肪),2.18±3.01倍(腹脂),2.07±0.37倍(胸肌),2.01±1.75倍(脾).结果符合MC4R作用机理,为畜牧生产及人类肥胖问题的研究提供间接依据.     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

陆地棉GhLipase基因的克隆、特征分析及定位

利用已构建陆地棉7235纤维cDNA文库测序, 结合5′RACE技术从陆地棉 (Gossypium hirsutum L) 7235纤维中获得了1个1 286 bp的cDNA。序列分析结果表明, 该cDNA 包含一个编码368个氨基酸的开放读码框, 5′非翻译区和一个带有Poly (A) 的3′非翻译区区域。与已报道的其它植物的脂肪酶基因具有较高的氨基酸序列同源性, 命名为GhLipase,提交到GenBank, 登录号为EU273298。RT-PCR分析表明, GhLipase在棉花的胚珠及纤维细胞中优势表达。Southern blot分析结果表明, GhLipase在陆地棉基因组可能存在两个拷贝。将该基因定位在四倍体棉花遗传图谱的A13染色体上。     

丹参海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SmTPS）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,得到一条海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）基因,将其命名为SmTPS,GenBank注册号为JF937196。该基因cDNA全长2836 bp,包含一个长为2574 bp的ORF,编码857个氨基酸。生物信息学分析表明,分子量为97.04 kD,等电点为5.76,含α-螺旋、β转角、延伸连和无规则卷曲。该蛋白同时具有海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（TPP）的功能结构域。系统进化树分析表明丹参TPS功能域和拟南芥AtTPS6属于一类,而TPP功能域与低等生物酵母ScTPS2属于一类。实时定量PCR结果分析表明,SmTPS基因在丹参不同组织器官中差异表达,其茎中表达量最高。在干旱和低温处理下,其表达量与对照相比均可上调约2倍,表明SmTPS基因在丹参抵抗干旱和低温胁迫中发挥一定的作用。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP6的克隆及表达初步分析

为探究ROP基因在棉花抵御逆境胁迫中的生物学功能,利用同源克隆的方法获得一个陆地棉GhROP6基因,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术探究GhROP6基因的组织表达特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式,构建GhROP6基因的VIGS载体并转化棉花,利用qRT-PCR技术检测其沉默效率。结果显示,GhROP6基因开放阅读框（ORF）为597 bp,编码一个含198个氨基酸的I类ROP蛋白;多重序列比对结果显示,GhROP6符合ROP蛋白结构特征,且与其他物种ROP蛋白高度同源;进化树分析结果显示GhROP6蛋白与拟南芥AtROP6蛋白同源性最高;GhROP6基因在棉花根、茎、真叶及子叶中均有表达,且在真叶中表达量最高;GhROP6基因对干旱、高盐、低温、高温等胁迫和外源脱落酸（ABA）、生长素（IAA）处理均有不同程度的响应,可能在棉花抗逆反应中扮演着重要角色。GhROP6在棉花的叶片和根部均得到有效沉默,表明已获得GhROP6基因沉默植株。本研究为进一步了解GhROP6基因的分子生物学功能奠定了基础。     

鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是保守的核受体超家族中的一员,属于核转录因子,GR对维持机体稳态起着重要作用,同时在动物繁殖代谢过程中扮演着重要的角色.本研究旨在克隆鸽子(Columba livia domestica) GR基因的cDNA全长并分析其组织表达谱.参照鸡(Gallus gallus domesticus)的GR基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了鸽子的GR基因的cDNA序列.测序结果表明,鸽子GR基因包含有2313bp的全长CDS序列,102bp的5'UTR序列,以及18 bp的3'UTR序列,共编码770个氨基酸(GenBank登录号:NM001037826.1).通过序列同源性分析发现,鸽子GR氨基酸序列与鸡的同源性为94％,与短吻鳄(Alligator mississippienses)的同源性为85％,与人(Homo sapiens)的同源性为75％.通过与鸡、鳄鱼和人的氨基酸序列比对分析发现,鸽子的GR氨基酸序列中有一个非常保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)和一个保守性较高的激素识别区(hormone recognition domain, LBD),此外还包括一个GR特异区域.利用qRT-PCR技术发现在鸽子不同组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、胰、肺、卵巢、腹部脂肪、肝、心、骨骼肌、肾、脾、输卵管、胃、下丘脑、大脑、肠和嗉囊.睾丸中表达量显著高于其他组织(P＜0.05),其次为胰腺和肺(P＜0.05),在嗉囊中的表达量显著低于其他各组(P＜0.05).本研究获得鸽子GR基因cDNA全长、组织表达规律,为进一步研究鸽子GR基因的功能提供了基础资料.     

黄颡鱼抗菌肽hepcidin基因的克隆和表达分析

用RT-PCR方法,从黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）肝脏中克隆获得了hepcidin cDNA序列,并对其进行序列测定,在此基础上分析了hepcidin基因在不同组织中的表达差异和不同细菌感染后对其表达的影响。结果表明,黄颡鱼hepcidin的cDNA片段（GenBank登陆号EU257703）长为282bp,编码93个氨基酸,由信号肽(23个氨基酸)、前肽（45个氨基酸）和成熟肽（25个氨基酸）组成,成熟肽含有8个保守的半胱氨酸（cys）残基,可形成4个链内二硫键。与已报道的其他鲶形目鱼类hepcidin核苷酸序列的同源性为80-82%,推导的氨基酸序列的同源性为69-71%。RT-PCR半定量分析显示黄颡鱼hepcidin基因在不同组织中普遍表达,其中肝脏表达水平最高,头肾、肠道、肌肉、脑、胃、鳃、心脏、卵巢表达次之,皮肤、脾脏、肾脏表达较低。感染嗜水单胞菌和腊样芽孢杆菌的黄颡鱼,肝脏hepcidin mRNA水平显著升高。     

砀山酥梨果实COMT基因的克隆和表达分析

梨果实石细胞的发育和木质素的合成、转运及沉积密切相关。咖啡酸氧甲基转移酶(COMT)是木质素合成途径中的1种关键酶,主要参与紫丁香基木质素(syringyl lignin,S-木质素)的生物合成。本研究以砀山酥梨果实为材料,利用RT-PCR技术并结合RACE方法,得到砀山酥梨COMT基因的全长c DNA,命名为Pb COMT(Gen Bank登录号为KC905086)。该基因全长1 371 bp,开放阅读框为1 098 bp,编码365个氨基酸。进化树分析发现砀山酥梨COMT蛋白具有很高同源性,与苹果的相似性达到94%。将该基因重组到表达载体p ET-32a(+)中进行原核表达,电泳检测到1条大约60.0 k D的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。荧光定量表达分析得知,梨果实Pb COMT基因表达量变化与木质素的含量变化趋势基本一致,并且和石细胞发育规律有很大的相关性。本研究为阐明梨石细胞发育分子机理奠定基础,为分子调控石细胞含量、改善梨果实口感提供了科学依据。     

云锦杜鹃RhLIS基因的克隆与表达分析

芳樟醇合酶(LIS)是植物香气化合物中芳樟醇合成途径的关键酶。为探究杜鹃花(Rhododendron spp.) LIS基因的功能及表达特性,解析芳樟醇的合成机理,本试验以云锦杜鹃(Rh. fortunei)为试材,利用反转录PCR(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆LIS基因全长cDNA序列,并应用顶空固相微萃取(SPME)与气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术,分析云锦杜鹃不同花期的花瓣及其他组织中LIS基因的表达水平和芳樟醇含量的变化关系。结果表明,从云锦杜鹃花苞cDNA中克隆得到RhLIS基因,含有完整的cDNA开放阅读框(ORF)序列长1 887 bp,编码628个氨基酸,与其他物种的LIS蛋白质氨基酸序列具有40%~50%的同源性;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,在不同花期的花瓣中,云锦杜鹃RhLIS表达水平先升高后降低,在盛开期的表达量最高,雄蕊中的表达量远高于雌蕊,幼叶高于老叶,花瓣高于花蕊和叶片。检测分析花香成分中芳樟醇的释放量,结果显示在云锦杜鹃不同花期的花瓣中,芳樟醇含量变化趋势与LIS基因的表达水平相一致,在半开期达到最大值,花蕊中芳樟醇含量均远低于花瓣;云锦杜鹃LIS基因的表达量与芳樟醇含量呈高度正相关。本研究结果为杜鹃花芳香品种的培育和改良提供了理论依据。     

肉鸡IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

干扰素（ＩＦＮ）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等活性的细胞因子。本研究通过ＰＣＲ从ＡＡ肉鸡基因组ＤＮＡ中克隆了ＩＦＮ－α（ＣｈＩＦＮ－α）基因,测序分析,并将该基因与表达载体ｐＱＥ３０相连,构建重组表达质粒ｐＱＥ３０／ＣｈＩＦＮ－α,以ＩＰＴＧ诱导在Ｍ１５中进行表达。测序结果表明ＣｈＩＦＮ－α的开放阅读框（ＯＲＦ）是由４８６个核苷酸编码的,成熟蛋白为１６２个氨基酸,有４个糖基化位点,推测     

花生油体蛋白家族基因的克隆和表达分析

油体蛋白是一类覆盖在油体表面的碱性小分子蛋白.油体蛋白的存在对于维护油体的稳定性非常重要,油体蛋白也是种子作为生物反应器表达重组外源蛋白的重要载体.本研究通过构建花生(A rac his hypogaea L.)未成熟种子的全长cDNA文库,测序得到284条编码油体蛋白的EST.根据编码蛋白分子量的大小可将花生油体蛋白基因分为6个亚族:AhOLE O- 16.9、AhOLEO- 17.7、AhOLEO- 18.6、AhOLEO-22、AhOLEO- 18.4和AhOLEO- 14.3 (GenBank登录号分别为:EG372527、EG373122、EG373716、EG372719、EE125019和EE124234),其中AhOLEO- 16.9,AhOLEO- 17.7和AhOLEO- 14.3分别有2个成员,其它家族的各只有1个成员.本研究首次从花生中克隆了分子较大的AhOLEO-22.cDNA芯片和半定量PCR结果表明6个亚族的油体蛋白基因在花生的不同器官和在种子不同发育时期表达模式相似,在根、茎、叶、花中几乎检测不到油体蛋白基因的表达,在种子中表达量高,在果针入土15d内几乎检测不到油体蛋白基因的表达,随着种子发育成熟油体蛋白基因的表达量逐步提高.本研究为研究花生油体蛋白基因的家族构成和利用花生油体蛋白基因提高花生含油量、生产外源蛋白等提供了有用的信息.