牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

为建立一种牛支原体(Mycoplasma bovis,MB)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速鉴别诊断方法,针对MB的uvr C基因和BVDV的5'端非编码区(5'-UTR)保守基因序列,分别设计两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为二个温度梯度,建立了鉴别MB和BVDV的二重二温式PCR方法。该方法能同时扩增MB和BVDV,扩增产物大小分别为412和170 bp。特异性试验结果显示,该方法对参试的所有毒株只扩增MB和BVDV基因组,对其它牛病原体无扩增;敏感性试验结果显示,该方法最低能同时检测到104拷贝的两种目的核酸;干扰性试验结果显示,该方法能同时检测两个模板不同浓度的组合,试验结果不受模板影响。综上,本研究所建立的二重二温式PCR方法特异、敏感、快速、简便,可应用于MB和BVDV临床鉴别诊断和流行病学调查。     

二种方法检测牛病毒性腹泻病毒的比较

荧光抗体试验(FA)是用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的传统方法。但由于此技术需要价格昂贵的荧光显微镜,复杂的操作程序及专门的试验人员,使该技术的应用受到限制。为克服FA的缺点,目前世界上一     

鸡细小病毒二温式PCR检测方法的建立

根据鸡细小病毒(chicken parvovirus,ChPV)的保守基因NS1设计了1对特异性引物,建立并优化了能够快速检测ChPV的二温式PCR方法。结果表明:该二温式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为302 bp的特异性条带,其最低能检测到38.6 fg的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。对60份临床样品进行检测,检出率为20%(12/60)。说明所建立的ChPV二温式PCR方法是一种快速简便、特异性强、敏感性高的检测方法,适用于ChPV的临床检测。     

牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因组序列,选择保守性比较高的5'非编码区,利用Oli-go6.0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。结果表明,该方法重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,极大地提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。临床初步应用表明,该方法可用于动物与疫苗生物制品原辅料BVDV的快速低含量检测。     

牛新孢子虫二温式PCR检测方法的建立与应用

根据已发表的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列设计合成一对特异性引物,采用均匀设计方法对引物浓度、Mg2+浓度、dNTP、Taq酶和退火温度进行了优化,建立了检测牛新孢子虫的二温式PCR方法.该方法对牛新孢子虫DNA的检测灵敏度为23.5 fg/反应.应用该方法对50份全血和8份流产胎儿样本进行了检测,有3份...     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示：该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10⁴和10³ copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%...     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒5'端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/粘膜病病毒244 bp片段的RT-PCR一步法。该方法对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒NADL、OregonC24V和长春184毒株各标准毒株检测,结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。检测460份不同样品,与病毒分离试验比较,符合率100%,证明该方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的一步法RT-PCR技术可用于牛病毒性腹泻/粘膜病的检测及流行病学调查。     

猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中BVDV-1、BVDV-2、CSFV及新出现瘟病毒的基因序列,设计2对特异引物,建立了能鉴别诊断BVDV与CSFV的Nested-PCR检测方法;确定其方法的特异性、敏感性、稳定性。建立的Nested-PCR能从BVDV标准毒株、猪源BVDV毒株中扩增198bp特异性片段,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。结果表明,该方法具有较好特异性;其敏感性可检测到0.195fg RNA模板量;经重复性试验表明该方法具有良好稳定性。初步应用检测表明,猪BVDV阳性率较高,达36.0%;牛血清及其制品、猪瘟活疫苗BVDV污染严重。本试验建立的Nested-PCR具有敏感、特异和稳定等特点,可用于临床诊断和流行病学调查。     

H1亚型禽流感病毒二温式PCR检测方法的建立

为了建立简便、快速检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的二温式PCR方法,根据H1亚型AIV血凝素(HA)基因设计合成了1对特异性引物并优化反应条件。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到1 pg的H1亚型AIV RNA。本研究建立的二温式PCR方法为H1亚型AIV感染的早期诊断与有效的防治提供了快速、特异、敏感的检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR诊断方法的建立

根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株的基因序列,分析合成了一对扩增跨幅为190bp左右的引物,对牛病毒性腹泻病基因I型或基因II型的毒株进行RT-PCR扩增,结果是取得了与预期大小一致的RT-PCR产物,而对照样品的扩增全为阴性;该方法最低可检测到0.10ng的牛病毒性腹泻病毒RNA。     

Establishment of a Duplex TaqMan Real-time PCR Method for Detection of Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2

【Objective】 This study was aimed to establish a duplex TaqMan Real-time PCR method for rapid detection of Bovine viral diarrhea virus types 1(BVDV1) and 2(BVDV2).【Method】 Specific primers were designed based on the 5'-non-coding region of 95 strains of BVDV1 and BVDV2 in GenBank.The positive plasmids containing the target fragments of BVDV1 and BVDV2 were constructed.The reaction conditions were optimized, the standard curve was constructed, the specificity, sensitivity and reproducibility of the duplex TaqMan Real-time PCR method were tested, and the established duplex TaqMan Real-time PCR assay was used to detect the clinical samples collected from Jilin province.【Result】 The results showed that the optimal annealing temperature of the duplex TaqMan Real-time PCR was 57.0 ℃, the optimum primer concentration was 0.5 μmol/L, and the optimum probe concentration was 0.3 μmol/L.The standard curves of BVDV1 and BVDV2 were Y=-3.54X+37.36 (R²=0.990) and Y=-3.18X+35.95 (R²=0.997), respectively.There was no specific amplification of Infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV), Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3), with intra- and inter-batch CV less than 3%, and the lower limit of detection was 10 copies/μL.The results of clinical samples showed that the overall positive rate was 23.1% (36/156), of which 17.9% (28/156) were positive for BVDV1 and 5.1% (8/156) were positive for BVDV2.【Conclusion】 In this study, a duplex TaqMan Real-time PCR method was established, which could identify BVDV types 1 and 2 simultaneously, quickly and accurately, and provided technical support for the prevention, control and purification of BVDV.     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法的建立

用兔抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)多抗作为包被抗体,BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体,建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法,对各项反应条件进行优化,最终获得最佳工作条件为兔多抗1∶1 600稀释包被,NS3单抗1∶2 000稀释,酶标抗体工作浓度为1∶4 000稀释。特异性和敏感性试验结果表明,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌无特异性交叉反应,其最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量,与RT-PCR方法的相比较,符合率为100%。所建立的BVDV抗原捕获ELISA方法快速、特异、敏感,可用于BVDV抗原的检测。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因5'-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%(18/25),与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒检测技术研究进展

牛病毒性腹泻(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)所致牛的一种接触性传染病,呈世界性流行,该病主要表现为腹泻、急慢性黏膜感染、繁殖障碍等,对畜牧业危害严重,是国际贸易中动物检疫的重要疫病之一。快速准确的检测手段,有利于该传染病的早期发现和及时控制。目前,用于检测牛病毒性腹泻病毒的方法很多,论文对近年来国内外应用的等温核酸扩增技术(IAT)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、指数富集配体系统进化技术(SELEX)、多重PCR技术、多重连接探针扩增技术(MLPA)、RT-PCR抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)等进行简要介绍,为我国动物检疫工作提供参考。     

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

引起牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)的病原为牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),牛感染后会出现与其他腹泻病相似的症状,仅通过临床表现和病理观察很难做出准确鉴别;其次持续感染(PI)牛是该病主...     

奶牛场病毒性腹泻清除计划的实施

对北京某牛场977头牛采用抗原捕获ELISA方法进行牛病毒性腹泻病毒持续感染牛的筛查,共检出8头阳性牛,其中后备牛7头、成母牛1头。在后续新生犊牛检测中检出1头阳性犊牛。后备持续感染牛表现不同程度的发育迟缓,配种延迟,与国外报道一致。以抗原检测为手段的持续感染牛的清除计划,可用于奶牛场病毒性腹泻的清除与控制。