草鱼呼肠孤病毒的研究进展

草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果,提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。     

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因Ⅰ型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因Ⅰ型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。     

草鱼呼肠孤病毒减毒的研究

草鱼呼肠孤病毒GCHV－892野毒株在PSF细胞中连续传代时，于培养液中加入一定浓度的桉液，传至19代已达减毒目的。继代至29代，其减毒效果保持稳定；传至27代后不再加入桉液，传代至37代，其减毒效果仍保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好，免疫原性强。用该弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后，草鱼的成活率和免疫保护率均达100％。因而作者认为桉液是草鱼呼肠孤病毒的一种良好减毒剂。经桉液减毒的GCHAV－892是一株可应用于生产上制备弱毒疫苗的良好弱毒株。     

草鱼呼肠孤病毒AH528株全基因组特征及进化分析

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的严重危害1~2龄草鱼的一种传染性疾病。本研究从安徽合肥地区患典型草鱼出血病的病鱼组织中分离到1株新的GCRV致病株,暂命名为GCRV-AH528。鱼体人工感染实验结果显示,实验鱼出现典型的出血病症状:体背发黑,鳍基部、腹部、口腔、鳃丝、肠道充血发红。全基因组特征分析显示,GCRV-AH528由11个双链RNA节段组成,节段大小在1027~3925 bp之间,AT平均含量为50.2%,GC平均含量为49.8%。与其他GCRVⅡ型毒株相比,L1节段在701~702位置缺少3个核苷酸(TAT),少编码1个酪氨基;M4节段出现突变,含2个开放阅读框,编码2个非结构蛋白NS9和NS69。所有节段两端均含有6 bp保守的末端核苷酸序列5'-GUAAU/CU…UU/GCAUC-3';另除L1、M6节段外,其余9个节段均在编码区两侧发现5~9 bp的颠倒互补序列。GCRV-AH528与其他呼肠孤病毒核苷酸平均相似度在37.1%~98.1%之间;编码蛋白平均相似度在24.3%~98.3%之间。基于VP1蛋白的聚类分析结果显示,该病毒属于水生呼肠孤病毒属,在氨基酸水平上与典型株GCRV-873株的进化关系较远。本研究结果表明,该毒株为一株新的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型致病株。     

草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发草鱼病毒性出血病,是危害性最大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成,共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。报告总结了呼肠孤病毒在基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞融合、细胞膜渗透、干扰素分泌、细胞分裂以及细胞压力小体等方面与宿主细胞相互作用的生物学研究进展;论述了蛋白酶抑制剂、RNA干扰(RNAi)机制、干扰素诱导素、GCRV干扰颗粒及小分子化合物等抗病毒策略的分子作用机制。报告预测基于中草药的免疫增强剂和口服化基因工程抗病毒疫苗将是最容易被市场化的两种绿色抗草鱼出血病药物。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒 (grass carp reovirus, GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物, 以病毒全基因组RNA为模板, 通过对反应条件进行优化, 建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明, 本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增, 扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带, 反应体系中添加SYBR Green I 荧光染料后, 绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高, 其最低检测限为33 pg, 与常规RT-PCR方法相比较, 灵敏度高10倍, 且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高, 且不需昂贵仪器设备, 为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。

     

草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发与应用

正随着水产养殖产业的不断扩大,我国已成为世界上最大的水产品生产消费和进出口国家。2000年至2013年,水产养殖产量以每年5%~6%稳步增长,在2013年,中国水产养殖产量达4.542×10~7t,占全球水产养殖总产量的60%以上~[1]。根据世界粮农组织数据显示,2015年我国水产养殖总量达7.430×107 t。这些数据表明我国水产养殖业不仅保障了中国水产品的市场供应,也对世界水产品供     

草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR检测方法的建立

利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R²)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×10¹～1×10⁶ copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)无检测信号。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR方法灵敏度高、特异性强,可进行定量分析,对草鱼出血病快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

草鱼出血病的病原研究

草鱼出血病的病原研究,始于50年代。1978—84年,分离到一种病原病毒,定名为草鱼呼肠孤病毒或鱼呼肠孤病毒。本文报道从出血病病鱼组织的电镜研究中发现两种病毒颗料,一种即是呼肠孤病毒,另一种是20-30nm大小的病毒。经病毒的核酸分析,前者是双股RNA病毒;后者为单股RNA病毒。用分离到的这两种病毒分别注入1足龄健康草鱼,可发生两类不同症状的出血病;呼肠孤病毒主要导致“肠出血型”症状;另一种病毒(经初步鉴别属于小RNA病毒科病毒)主要导致“肌肉出血型”出血病。由此,可以证实两种病毒都是草鱼出血病的病原病毒,同时也初步解释出现两种不同症状出血病的原因。     

紫外线诱变建立草鱼抗出血病病原病毒的AHZC88细胞株

通过UV对草鱼出血病病原病毒敏感的草鱼ZC 7901细胞株反覆诱变,获得了对出血病病原病毒具有抗性的AHZC 88细胞株。经生物学特性测定,AHZC 88细胞的染色体2n=48,温度适应范围4°～38℃,最适生长温度27℃,分裂指数在36小时时达最高值。经病原病毒的人工侵染等试验表明,AHZC 88细胞不受草鱼出血病病毒感染。在电镜切片观察中,细胞内不见病毒颗粒。LDH同工酶分析,比敏感细胞少1条酶带。     

草鱼呼肠孤病毒JX-0902株的分离和鉴定

收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0902)基因组由11条dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征,但基因组带型与GCRV 873株存在差异,而与HZ08株接近。根据GenBank上已提交的草鱼呼肠孤病毒S6序列(GQ896337)设计特异引物,以JX-0902株的cDNA作为模板,可扩增出特异性条带。基于S6序列的聚类分析结果显示,JX-0902与GCRV HZ08株、GD108株S6同源性高达98%、99%,该分离株应为草鱼呼肠孤病毒。     

基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35 蛋白进行GCRV-VLPs的组装.实验将编码VP35 蛋白的GCRV-s11 基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTATM,然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35.将穿梭质粒 Bacmid-VP35 以及实验室前期构建的重组穿梭质粒 Bacmid-VP3、Bacmid-VP4 分别转染Sf9 昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3 以及pFHB-VP4.利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的表达情况.结果显示,实验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的Sf9 昆虫细胞中正确表达.将成功表达蛋白的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3 以及pFHB-VP4 共感染Sf9 细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)观察VLPs的组装情况.结果显示,GCRV-Ⅱ的 3 个蛋白在Sf9 昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径为 65～72 nm.本实验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定了基础.     

草鱼出血病的电镜观察

草鱼出血病是由呼肠孤病毒感染所致的急性传染病,由于病鱼小血管受损引起全身性出血,并造成内脏器官和体壁肌肉组织局灶性病变。电镜观察表明病变细胞内各种细胞器的数量较正常细胞显著减少,形态结构也遭损坏。质膜的三层结构模糊不清,及至解体消失。与机体代谢密切相关的粗面内质网、滑面内质网、线粒体和高尔基复合体的数量减少及结构受损,使蛋白质、糖类和脂质合成及分解等一系列细胞代谢活动不能正常进行,加速了病鱼死亡。     

应用Dot_ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究

报道了斑点免疫吸附ＥＬＩＳＡ（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）快速检测草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果,并对该方法的灵敏度与ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法进行了系统的比较。结果表明,Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出ＧＣＨＶ的最低含量为３ｐｇ,该灵敏度比ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法分别提高１０倍和２０倍,而且快速易行,是目前检测ＧＣＨＶ最为有效的方法,并可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。     

草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果

为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫注射第21天人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。