Bar基因的玉米花粉管通道法转化

通过花粉管通道法利用抗除草剂基因（bar）转化3个玉米自交系,D0代获得35株GUS阳性植株．其中17株PCR阳性植株,除草剂筛选获得抗性植株13株。研究发现DNA溶液浓度影响转化率,当浓度为100μg／ml时,转化率最高,为2．61％。DNA导入时间距人工授粉时间的延长,结实率升高,但转化率显著下降,人工授粉后1d导入DNA产生的转化株最多,为19株,平均转化率为1．35％。     

玉米三种不同花粉管通道法转化BcBCP1基因的初报

采用DNA柱头滴加法、花粉粒携带法和开苞叶导入法等3种不同的花粉管通道遗传转化方法,将抗逆基因BcBCP1转入3个玉米自交系合344、农大178和郑58中,对3种方法的部分影响因素进行了优化,旨在筛选出转化效率高的方法,为玉米转基因育种提供技术支持。结果表明:DNA柱头滴加法的DNA溶液浓度100g/mL,授粉后18h转化率最高。花粉粒携带法最佳处理时间为10min。开苞叶导入法在授粉后18h转化率最高,DNA浓度为100μg/mL。T0代共筛选出338株除草剂抗性植株,其中87株PCR呈阳性。DNA柱头滴加法的平均PCR阳性率最高,为1.99%;而花粉粒携带法的平均PCR阳性率最低,为0.23%;开苞叶导入法平均PCR阳性率居中,为0.32%。     

Bar基因的亚麻花粉管通道法转化

[研究目的]为鉴定T1代转基因亚麻植株中抗除草剂基因(bar)整合是否成功。[方法]通过花粉管通道法将bar基因导入转化植株,以叶片涂抹法对T1代转化植株进行田间草丁膦最低致死浓度筛选;以最低致死浓度草丁膦进行田间喷施后筛选耐受草丁膦药液的抗性植株,并用PCR检测bar基因阳性的抗性植株数目。[结果]草丁膦对T1代转化植株的最低致死浓度为100 mg/L。得到耐受草丁膦药液的抗性植株44株,PCR检测结果表明,8株为PCR阳性植株,平均转化率为18.2%。[结论]花粉管通道法将bar基因成功转入亚麻基因组。     

利用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入小麦的研究

兔防御素NP-1是抗性谱最广的防御素之一。为提高小麦的抗病虫能力,培育优质高抗的小麦品种,采用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入优质小麦品种G8901。对得到的193株T0植株进行抗除草剂筛选,获得4株抗性植株。通过PCR及PCR-Southern杂交,证实了NP-1基因已经整合到转基因植株的基因组中,并稳定遗传到T1。田间抗病虫鉴定结果表明,这些植株对于白粉病、叶锈和条锈病有较强的免疫力和抗性,但对于蚜虫的抗性没有明显提高。     

转新型抗草甘膦基因棉花的转化效率及相关分子特征分析

培育抗草甘膦除草剂棉花品种对棉花生产具有重要意义。利用农杆菌介导法获得了大量抗除草剂草甘膦棉花的再生植株,对其进行阳性检测。通过确定PCR检测目标条带大小、蛋白杂交条带大小分子特征,对65个独立转化事件在DNA水平、蛋白水平进行分析和筛选。结果表明,经PCR检测再生植株DNA得到的阳性率平均值为81.5%,经过蛋白检测后阳性率确定为55.4%,该类阳性植株即为外源基因正常表达的转基因植株。在此基础上,结合田间抗性检测,对其中9个株系进行了不同世代的选择,经过综合鉴定筛选,发现2个抗性优良的转基因株系具有极高的利用价值,其余还需进一步筛选鉴定。     

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定：首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg／L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1％的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62．5％的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。     

将拟南芥ATNCED3基因导入玉米自交系的研究

采用花粉管通道法将ATNCED3基因转入优良玉米自交系昌7-2,在T0代植株三叶期喷洒浓度为200mg/L草铵膦除草剂进行抗性筛选,共得到5株草铵膦抗性植株。对这5株草铵膦抗性植株进行PCR、PCR-Southern及RT-PCR检测,结果表明5株均为阳性植株,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,并得到表达。在干旱条件下初步比较了对照和转基因株系叶片的相对含水量、脯氨酸含量,相对电导率等生理生化指标,结果表明,转基因株系各种指标均好于对照,暗示其抗旱性有所提高。     

基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究

本研究以优良玉米自交系X2211和78599的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用基因枪介导法将抗除草剂基因2mG2-epsps导入玉米胚性愈伤组织,经草甘膦(glyphosate)筛选,产生抗性愈伤组织并获得320株再生植株,通过喷施除草剂筛选,有65株表现良好的耐除草剂特性。PCR分析表明,其中的7株表现PCR阳性,初步证明2mG2-epsps基因整合到玉米基因组中,平均转化率为2.2%。同时研究了金粉用量和轰击距离对玉米基因枪转化效率的影响。转化时以金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm最佳。     

小麦Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析

采用基因枪法将小麦反义Mlo基因导入扬麦158和济麦20的幼胚愈伤组织中,在含除草剂的分化培养基上经两轮筛选,获得抗性再生植株。PCR检测、PCR-Southern杂交、基因组DNA斑点杂交和除草剂BASTA抗性分析结果证实已获得转基因扬麦158和济麦20阳性植株,荧光定量表达分析亦证明Mlo基因发生沉默。对T₀和T₁代转基因植株的白粉病抗性鉴定表明,有6个转基因株系高抗白粉病。对T₁代转基因小麦接种白粉菌后孢子发育的显微观察结果显示,Mlo反义基因的导入明显加快了乳突的形成和维持时间,有效抑制了吸器的发育,因而使转Mlo反义基因材料表现抗病性。     

导入Chi-linker-Glu和Bar基因获得抗真菌和抗除草剂的转基因烟草

构建重组表达载体pBIb-CG(含有Chi-linker-Glu融合基因和Bar基因),利用农杆菌介导法将其携带的Chi-linke1r-Glu融合基因和Bar基因转化烟草(Nicotiana tobaccum L.)品种红花大金子.经根癌农杆菌侵染和共培养后,用100mg/L Kar+500mg/L Cef筛选抗性芽,获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37％;分别对抗性再生植株中Chi-linker-Glu融合基因和Bar基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90％.PCR、Southern杂交结果证明,外源基因已整合到烟草基因组中.离体抑菌试验和除草剂抗性试验表明,转基因烟草植株对木霉菌(Tricho derma viride)、镰刀菌(Fusarium solanif sppisii)和除草剂都表现出一定的抗性.