枸杞属RAPD反应体系优化

以枸杞属植物为材料,进行RAPD反应体系的优化.结果表明,在25 μl总反应体系中,以DNA模板量为30 ng,引物0.6 μmol/L,dNTP 150 μmol/L,Mg2+ 2.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶0.75 U,10×反应缓冲液2.5 μl为最优反应条件.PCR的反应程序为:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性20 s,36 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性20 s,40 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,40个循环;72 ℃延伸10 min.应用优化后的反应体系获得的RAPD指纹图谱带型清晰,重复性好.     

硅胶干燥罗布麻叶片DNA提取及RAPD反应体系建立

[目的]得到适用于罗布麻RAPD的最优体系.[方法]以伊犁地区新源县罗布麻硅胶干燥叶片为材料,采用TIANGEN试剂盒提取罗布麻基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplified polymorphic DNA)分析的罗布麻基因组DNA.[结果]通过单因素优化实验,得到罗布麻RAPD分析的最佳反应体系为:Mg2+ (2.0mmol/L)、dNTPs(0.5 mmol./L)、primer(0.4 mmol/L)、DNA(1μL)、Tap酶取1μL、10×buffer取1μL,总反应体系为10 μL;扩增程序为:在94℃下预变性,然后进行42个循环(94℃变性30 s、38℃退火30 s、72℃延伸2min),最后在72℃延伸7 min.[结论]提取的罗布麻总DNA均有较高的质量,适合RAPD分析;Tiangen植物基因组DNA提取试剂盒对罗布麻基因组DNA有着良好的提取效果;对罗布麻RAPD-PCR中Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶和引物浓度进行优化,较为理想的各因子用量和扩增程序为:Mg2+(2.0 mmol/L)、dNTPs(0.5mmol/L)、primer(0.4 mmol/L)、Tap酶(0.5 U/μL)、DNA(40 ng),总反应体系为10 μL;扩增程序为:在94℃下预变性5 min,然后进行42个循环(94℃变性30 s、38℃退火30 s、72℃延伸2 min),最后在72℃延伸7min.     

大蒜RAPD反应体系的建立及优化

该试验以弥渡紫皮大蒜叶片基因组DNA为试材,采用不同浓度MgCl2、引物、dNTP、TapDNA聚合酶对大蒜的RAPD体系进行单因素反应条件优化.结果表明,25μL总反应体积中,最佳浓度配比为模板DNA 40ng,MgCl2 2.0 mmol/L,引物12 pmol,dNTP 50μmol/L,Taq DNA聚合酶1 unit,10×反应缓冲液2.5μL.扩增程序为94℃变性3 min,94℃变性30 s,37℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃最终延伸10 min.     

栓皮栎RAPD反应条件优化研究

通过单因素2循环试验对栓皮栎RAPD反应条件进行系统优化,探讨了RAPD各反应条件间的交互作用,建立了栓皮栎RAPD的最佳反应体系和扩增程序.结果表明:(1)各反应因素对栓皮栎RAPD扩增具有不同影响,各因素间的交互作用明显,单因素多循环试验设计能够有效的减少其交互作用、优化出RAPD扩增的最佳反应体系和程序;(2)适合栓皮栎RAPD反应的体系总体积为20 μL,模板DNA用量30 ng,Taq DNA聚合酶用量1.75U,引物用量8 pmol,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,dNTPs浓度0.25 mmol·L-1,10×Buffer 2 μL;适合栓皮栎RAPD扩增的程序是94℃预变性4 min,94℃变性40 S,40℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环,72℃延伸10 min.     

蓖麻RAPD-PCR反应体系的正交优化

以东北蓖麻为材料建立蓖麻RAPD反应优化体系,用于蓖麻遗传多样性分析.用CTAB提取蓖麻基因组DNA,采用正交试验对影响蓖麻RAPD-PCR扩增的反应组分浓度进行优化.结果表明最佳的蓖麻RAPD-PCR反应体系(25μ1)中含10xbuffer 2.5μ1,模板DNA 4ng/μ1,dNTP 0.4mmol/L,引物0.321μmol/L及Taq酶0.1U/μ1.扩增程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min20s;40个循环;72℃延伸5min.通过正交体系优化,获得了较优的蓖麻凡RAPD-PCR反应体系,为蓖麻RAPD分子标记提供了理论基础.     

菜心ISSR-PCR反应体系的优化

以菜心(Brassica campestris L. ssp. Chinensis Var. utilis Tssen. et Lee.)为材料, 对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如Mg2 、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Primer、模版DNA的浓度及引物退火温度、延伸时间和循环次数进行了探讨, 确立了适合菜心ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数 在25 μL反应体系中含10×buffer 2.5μL, 2.0 mmol/L Mg2 , 0.5 U Taq DNA聚合酶, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 30 ng模板DNA. PCR扩增程序 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性1 min, 49.7～56 ℃退火(退火温度随引物不同而定)1 min, 72 ℃延伸45 s, 40个循环; 72 ℃延伸5 min.     

柱花草单粒种子DNA提取和RAPD扩增

以7个柱花草品种的单粒种子为材料,采用改良的CTAB法提取DNA,进行RAPD扩增.结果表明,采用单粒种子提取的DNA完整性好.采用模板3μL,随机引物2μL(10μmol/L),dNTPs 2.5μL(2.mmol/L),Taq酶0.2μL(5 U/μL),MgCl2溶液2μL(25mmol/L),10×Buffer2.5μL(500 mmol/L KCl,100mmo1/L Tris-C1,pH 9.0,25℃,10 mL/L Triton X-100),无菌水12.8μL,总体积为25μL的反应体系,可扩增出谱带清晰的RAPD产物.扩增程序为94℃预变性4 min;94℃变性30 s、37℃复性30 s、72℃延伸90 s,共40个循环;72℃延伸6 min.     

均匀设计优化喜盐鸢尾ISSR-PCR体系

以新疆野生喜盐鸢尾DNA为模板, 采用U20(54)和U12(34)均匀设计表,通过4因素5水平和4因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素如Mg2+ 、dNT P、引物以及TaqDNA聚合酶浓度以及循环数和退火温度等进行优化筛选, 建立了适合喜盐鸢尾的最佳ISSR-PCR反应体系:在25 μL反应体系中,包括2.5 μL 10×PCRBuffer ,2.0mmol/L M g2+,250 μmol/L dNTP,0.1 μmol/L 引物,0.5U TaqDNA 聚合酶,40 ng模板DNA.扩增程序为 :94℃预变性3 min;接着进行40个循环:94℃变性45 s,52.1℃退火30 s,72℃延伸1.5 m in;循环结束后,72℃延伸5 min,4℃保存.     

结球甘蓝RAPD反应条件的优化

以甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)基因组DNA为模板,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,优化了甘蓝的RAPD反应体系,调整了扩增程序.该体系反应总体积为20μL,其中25mmol/L MgCl2 2.0μL,10×PCR Buffer 2.0μL,10mmol/L dNTP 0.5μL,5U/μL Taq E 0.5μL,20ng/μL Primer 1.5μL,10ng/μL模板DNA 3μL,灭菌双蒸水10.5μL.适宜的扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性1min,37℃复性1min,72℃延伸1.5min,40个循环;72℃延伸10min后15℃保存.     

南瓜RAPD分析体系的优化*

 为确保南瓜RAPD反应结果的稳定性和重复性，对MgCl₂浓度、dNTPs浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA浓度、复性温度、PCR循环次数等影响南瓜RAPD结果的重要因素进行了初步研究。最终优化的南瓜 RAPD反应体系为25 μL反应液中：10×反应 buffer（100 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L KCl, 80 mmol/L (NH₄)₂SO₄ ,pH 9.0,NP-40）2.5 μL, 3 mmol/L MgCl₂，0.2 mmol/L dNTPs，Taq酶l.0 U,引物15 ng/μL ，DNA模板10 ng/μL 。本研究最终确立的PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min,然后按94 ℃变性30 s,37 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s，进行40个循环,最后72 ℃延伸5 min。在此条件下得到的RAPD图谱可为南瓜遗传多样性、分子标记及辅助育种等研究提供有效的手段。