铜缺乏奶牛肝脏金属硫蛋白的电泳特征

本实验选择铜缺乏区有明显临床症状的奶牛 6头 ,采集肝脏样品后用差速离心法分离肝脏金属硫蛋白 (MT) ,以Sephadex-G75进行柱层析纯化 ,将纯化后的 MT进行 SDS-PAGE不连续电泳 ,并作考马斯亮兰染色及扫描分析。将 6头健康奶牛的肝脏样品作为对照。实验结果表明 ,健康奶牛肝细胞浆 MT经不连续 SDS-PAGE电泳时可出现两条清晰的区带 ;发病奶牛的 MT除表现条清晰区外 ,同时在负极端条带前后位置均出现较为明显的杂带。发病奶牛的区带 及区带 的含量均显著大于健康奶牛。结论 :铜缺乏能够改变奶牛肝脏中 MT的代谢     

镉暴露家兔睾丸和肝脏中小分子金属结合蛋白的分离与比较

 【目的】通过对镉暴露家兔睾丸和肝脏中小分子金属结合蛋白分离与比较,揭示动物睾丸组织镉高敏感性的机制。【方法】6月龄雄性青紫兰家兔经皮下染镉,9 d后将兔子杀死,制备睾丸和肝脏匀浆超离上清液,用Sephadex G-75凝胶层析法进行蛋白分离,经双波长（280 nm和254 nm）测定紫外吸收和原子吸收分光光度法测定Cd、Zn元素含量两种方法确定洗脱液小分子量金属结合蛋白峰管;通过试验比较它们的紫外扫描特性、热稳定性、镉锌元素比值和氨基酸组成。【结果】肝脏分离蛋白分子量为6.0～10.0 kD,有254 nm特征紫外吸收峰,OD250nm/OD280nm的值为13.13,有较好的热稳定性,不被无水乙醇抽提,每摩尔物质中Cd与Zn的摩尔比为4.7﹕2,半胱氨酸相对比例为32.89%、不含芳香族氨基酸、氨基酸组成与MT的理论值非常接近。睾丸分离蛋白无254 nm特征紫外吸收峰,Cd结合能力低,半胱氨酸相对含量只有2.36%,氨基酸组成与MT的理论组成相差较大。【结论】雄性动物睾丸对镉暴露敏感性高的原因是睾丸中不能被诱导产生能够拮抗重金属镉毒性作用的特殊蛋白质——金属硫蛋白。     

日粮添加高水平硫酸锌和纳米氧化铜对鸡脏器组织锌铜沉积的影响

 【目的】研究高锌（硫酸锌）常铜（纳米氧化铜）日粮对鸡脏器组织铜锌含量的影响,探讨Zn2+与纳米氧化铜在消化道吸收时的互作关系。【方法】选取1日龄SPF白莱航蛋用公雏120只,随机分为4组,每组5个重复。1组为对照组,饲喂基础日粮（以纳米氧化铜的形式添加铜8 mg•kg-1）;2—4组为高锌组,以ZnSO4•7H2O的形式分别在基础日粮中添加锌250、500和1 000 mg•kg-1。【结果】日粮添加锌250—1 000 mg•kg-1,受试鸡肝、腺胃、十二指肠和空肠中锌和金属硫蛋白含量显著高于对照组（P＜0.01或P＜0.05）,鸡十二指肠铜含量极显著高于对照组（P＜0.01）。日粮添加锌1 000 mg•kg-1时,空肠铜含量极显著高于对照组和日粮锌添加组（锌添加量分别为：250和500 mg•kg-1,P＜0.01）。试验至42 d,日粮添加锌500和1 000 mg•kg-1时,鸡肝脏铜含量极显著高于对照组和日粮锌添加组（锌添加量为：250 mg•kg-1,P＜0.01）。日粮锌水平与鸡肝脏、十二指肠、空肠和腺胃锌含量呈显著正相关（P＜0.05）,与十二指肠、空肠铜含量呈显著正相关（P＜0.05）,与肝脏铜含量呈正相关（P＞0.05）,与十二指肠、腺胃和空肠金属硫蛋白含量呈正相关（P＞0.05）。肝脏金属硫蛋白含量和铜含量呈极显著正相关（P＜0.01）;十二指肠、空肠金属硫蛋白含量和铜含量呈正相关（P＞0.05）。【结论】日粮添加高水平硫酸锌没有拮抗鸡对纳米氧化铜的消化吸收,纳米氧化铜在消化道可能是以纳米颗粒的形式吸收。     

铜缺乏奶牛神经递质酶的组化特征

为探讨铜缺乏对奶牛大脑、小脑及脊髓乙酰胆碱酯酶(ACHEase)组化特征(分布特点及活性)的影响.本实验选择铜缺乏症高发区自然发病的奶犊牛6头.剖杀后采集大脑、小脑、脊髓作冰冻切片及酶组化染色.以6头同年生健康奶犊牛为对照.实验结果表明.发病奶牛大脑、小脑及脊髓中ACHEase计数值均显著低于对照组奶牛(P(0.05);除大脑外,铜缺乏奶牛脊髓上小脑中ACHEase的扫描值也显著低于对照组(P(0.05);发病奶牛组织中ACHEase酶颗粒的分布也发生特征性的变化.结论:神经递质酶活性的改变是导致奶牛铜缺乏症病理过程的重要原因.     

萱草花粉微管蛋白的生物化学性质

以萱草花粉为材料，采用丙酮粉法、QAE-Sephadexaso离子交换层析及FPLC技术作为主要分离纯化手段，纯化了毫克数量的萱草花粉微管蛋白，并研究了微管蛋白的生物化学及生物物理学部分性质。试验结果表明：纯化的微管蛋白在20℃时沉降系数为6．2s；α、β2个亚基的分子量分别为56，58kD；凝胶扫描分析纯度为93．7％；等电聚焦电泳测定等电点（PI）为5．35。光谱学性质研究表明其最大紫外吸收峰为280．8nm；荧光光谱研究表明其最大激发波长为282nm，此时的最大发射峰为338nm；圆二色光谱分析二级结构是α-螺旋占27．24％、β-折叠占24．48％、无规则卷曲为48．28％，呈典型球蛋白特征。     

饲粮中添加锌对仔猪不同组织微量元素沉积的影响

105头"杜长大"仔猪,随机分为5组(每组3个重复),分别饲以添加100,200,3000 mg/kg氧化锌,100,200mg/kg蛋白锌的相同饲粮,进行了为期30 d的饲养试验,并在饲养试验结束后,从每组中各选取6头试验猪(公母各半)进行屠宰.采集血清、肝脏、胰脏、肾脏和背最长肌等样品,应用原子吸收法测定了样品中铜、锌、铁的含量和肝脏中金属硫蛋白的含量.结果表明,饲粮中添加3000 mg/kg氧化锌和200mg/kg蛋白锌使仔猪日增重分别提高了21.24%(P＜0.01)和16.95%(P＜0.05),采食量提高了1 4.55%(P＜0.01)和9.09%(P＜0.01);料重比以100mg/kg蛋白锌组为最佳,较对照组降低了6.95%(P＜0.01),其次为200 mg/kg蛋白锌组和3000mg/kg氧化锌组,分别降低了5.79%(P＜0.01)和3.86%(P＜0.05).微量元素测定结果显示,3000 mg/kg氧化锌组和200mg/kg蛋白锌组的肝脏锌含量分别达对照组的7.4倍(P＜0.01)和2.3倍(P＜0.01),胰脏锌含量分别比对照增加16.8倍(P＜0.01)和10.3倍(P＜0.01);3000 mg/kg氧化锌、100mg/kg、200mg/kg蛋白锌组肝脏金属硫蛋白含量分别达对照组的13倍(P＜0.01)、2.4倍(P＜0.05)和4.7倍(P＜0.01);添加锌对血清、肾脏和背最长肌中锌含量无显著影响,所测血清和组织中铜、铁含量也未发现有显著差异.     

食物源性铜、锌对鸡体内铜代谢的影响

实验结果表明:鸡饲料中添加的铜越多,向胆汁排泄的铜越多,肝脏对铜并无显著的积累作用。当鸡饲料中补充锌以后,可以诱导肠粘膜浆液中金属硫蛋白(MT)结合更多的铜。但若先以锌诱导MT合成,然后再同时补充铜时,与MT结合的铜并无明显增多,胆汁中排出的铜还略有下降,肝脏中亦无过多铜的积累作用。因而提示锌有占位性结合在肠粘膜浆液中MT上,妨碍了它进一步与铜结合。并减少铜的真性吸收。     

烟草叶片铜锌超氧化物歧化酶的纯化和性质

经硫酸铵分级沉淀、SephadexG - 75凝胶过滤和DEAE - 3 2层析 3个步骤 ,将烟草叶片中Cu·Zn -SOD纯化到均一程度。测定结果表明 ,酶比活力达 2 2 60U/mgpr,酶的亚基分子量为 16 7kD、N -末端氨基酸为丙氨酸 ,该酶在紫外光区最大吸收峰为 2 63nm ,其铜、锌含量分别为 0 4 5 %和 0 5 2 %。     

采食含高硫、钼日粮的肉牛对甘氨酸铜中铜的生物利用率

选择60头平均9月龄、初始体重为277kg的肉牛,饲喂含高硫（S）和钼（Mo）日粮,进行148d试验,测定甘氨酸铜（CuGly）相对饲料级硫酸铜（CuSO4）的生物利用率。肉牛包括29头安格斯牛,31头安格斯与西门塔尔杂交牛,按体重随机分配到5个处理组中,分别为：①对照组（不添加铜）;②含铜5mg·kg^-1干物质,以硫酸铜形式添加;③含铜10mg·kg^-1干物质,以硫酸铜形式添加;④含铜5mg·kg^-1干物质,以甘氨酸铜形式添加;⑤含铜10mg·kg^-1干物质,以甘氨酸铜形式添加。肉牛以玉米青贮饲料为基础日粮（含铜8.2mg·kg^-1干物质）,采用单栏饲喂。阶段1,在肉牛日粮中添加钼2mg·kg^-1干物质、硫0.15%,持续120d;随后,在阶段2肉牛日粮中添加钼6mg·kg^-1干物质、硫0.15%,持续28d。添加硫酸铜和甘氨酸铜都能极显著改善平均日增重和增重饲料比（P=0.01）。与对照组相比,添加铜组试验结束时肉牛血浆铜蓝蛋白,血浆铜和肝脏铜值显著提高（P〈0.05）。与处理②和④组肉牛相比,处理③和⑤组肉牛血浆铜、肝脏铜和血浆铜蓝蛋白值显著升高（P〈0.05）。阶段1,根据结束时血浆铜、肝脏铜和血浆铜蓝蛋白值做多元线性回归,甘氨酸铜中铜相对硫酸铜（100%）的生物学利用率分别为140%（P=0.10）,131%（P=0.12）和140%（P=0.01）。阶段2,添加钼6mg·kg^-1干物质后,与硫酸铜中铜相比,甘氨酸铜中铜的相对生物学利用率极显著升高（P=0.01）,根据血浆铜、肝脏铜和血浆铜蓝蛋白值,分别为144%,150%和157%。试验结果显示,与硫酸铜相比,高硫、钼日粮中甘氨酸铜中的铜更有效。     

热应激状态下泌乳奶牛通过激活GHIGF-I轴增强糖异生变化

【目的】选取分娩1周后的泌乳期荷斯坦奶牛6头,提前适应期1周后,正式饲喂从2013年6月29日至8月5日,总共35 d(5周),使泌乳奶牛处于热应激状态。进而检测泌乳奶牛乳产量及乳蛋白含量,血液中生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、葡萄糖以及肝脏中热休克蛋白70(HSP70)和糖异生作用的变化情况,拟从GH-IGF-I轴的角度阐明泌乳奶牛发生热应激时对糖异生作用及乳品质下降的机制。为进一步揭示奶牛热应激的发生机理及控制奶牛热应激的发生提供理论依据。【方法】分别统计第1—5周泌乳奶牛的产奶量及分析乳蛋白含量,并采集泌乳奶牛颈静脉血液和进行活体采取肝脏组织的方法,检测血液中葡萄糖和GH、IGF-I的含量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对奶牛肝脏组织中HSP70和糖异生的关键酶丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)进行检测。【结果】在35 d的饲喂过程中,日间平均气温在32℃以上的持续时间达25 d,且最高温度为38℃,高温持续时间大于72 h,即此气候条件下奶牛处于一个热应激状态。随着泌乳奶牛热应激程度的不断加深,从第1周到第5周产奶量和乳蛋白含量都有不同程度的下降。通过比较第5周和第1周泌乳奶牛肝脏中HSP70的表达,发现第5周HSP70的表达量极显著高于第1周。检测血液中GH、IGF-I以及葡萄糖的含量,发现在第5周的时候其含量均高于第1周且差异显著(P0.05);检测泌乳奶牛肝脏组织中PC和PEPCK的表达水平,发现第5周显著高于第1周(P0.05);通过检测第5周与第1周肝脏组织中GH和IGF-I受体的表达水平,发现GHR和IGFR同样上调,其中IGFR显著上调(P0.05)。【结论】随着泌乳奶牛热应激的程度的不断加深,血液中的葡萄糖含量显著升高,其可能是由于垂体分泌的GH刺激肝脏产生更多的IGF-I,即通过GHIGF-I轴上调肝脏糖异生途径关键酶的表达,使糖异生途径处于激活状态。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前体物被过多的用来进行糖异生作用,增加血液中葡萄糖含量,维持机体正常供能所致。     

铜、钼、硫对肝细胞浆液内咪噻宁代谢的影响(Ⅱ)

本文通过一系列试验指出:1、硫钼酸盐可明显地减少大鼠的肝、肾、肠内与MT结合的铜浓度,尤以肝、肾最明显,而对Zn-MT的结合作用没有明显影响。硫钼酸盐对牛的肝细胞浆液中与MT结合的铜有类似的影响。同时它还有延迟静脉注射的铜进入肝浆与MT结合的作用。2、饲料中添加钼和硫后,于第1个月内,肝内MT浓度在肝铜大量丢失之初,由于肝内可动员铜大量释放,Cu-MT浓度增加,随后则逐渐降低。3、铜可以诱导缺铜牛肝浆内MT的合成,这种合成作用在静脉注射铜后6-10h开始,于24～48h达到峰值浓度。铜诱导了肝浆液中MT合成以后,不仅Cu-MT浓度增加,而且Zn-MT浓度也增加。因而提示MT上可能存在着至少两个结合部位,一个结合铜,另一个结合锌。     

几种牛副结核琼扩抗原的比较

利用免疫学方法制备了牛副结核细胞浆抗原、细胞壁声波粉碎抗原、Sephadex-G200层析抗原和草柱亲和抗原，分别与牛副结核阳性、弱阳性及阴性血清进行琼扩散试验。结果表明：细胞浆抗原、细胞壁超声波粉碎抗原与阳性、弱阳性血清之间，以及层析抗原和草柱亲和抗原与阳性血清之间有沉淀线出现，而其它的均无沉淀线出现。12个月后，重复该试验，结果细胞浆抗原、细胞壁超声波粉碎抗原阳性血清之间有沉淀线出现，而与弱阳性血清之间以及层析抗原和草柱亲和抗原与阳性血清之间均推动了沉淀线。结果显示：细胞浆抗原和细胞壁声波粉碎抗原在用作牛副结核琼护抗原时，优化层析抗原和草柱亲和抗原。     

类芽孢杆菌胞外胆固醇氧化酶的分离纯化

[目的]探讨类芽孢杆菌产生胞外胆固醇氧化酶(COD)的分离、纯化方法,为其生产和应用提供技术支持.[方法]将类芽孢杆菌发酵液通过旋转蒸发浓缩、蔗糖透析浓缩、DEAE离子交换柱层析和凝胶层析,纯化目的蛋白,然后测定获得酶的基本酶学性质.[结果]类芽孢杆菌发酵液经DEAE离子交换柱层析和SephadexG-75凝胶柱层析后,纯化所得的COD比活力达6.83U/mg,酶活力回收为35.6%,纯化倍数为13.4倍.纯化酶经SDS-PAGE显示为均一条带,分子量约58 kDa.将纯化的COD作用于不同浓度胆固醇,采用Lineweaver Burk作图法,测得其Km=3.3×10-5 mol/L.薄层层析结果显示,产物为胆甾-4-烯-3-酮,说明纯化所得酶是COD.[结论]纯化获得电泳纯类的芽孢杆菌胞外COD,其与底物亲和力较强,具有潜在的应用研究价值.     

冠突散囊菌胞外多糖的分离纯化

冠突散囊菌液体深层发酵滤液经浓缩,醇析,透析冻干得多糖粗品.粗多糖经Sevag法脱蛋白,DEAE-52阴离子交换柱层析纯化得到4种多糖.将含量最高的多糖ECP-A经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析得到纯化的冠突散囊菌胞外多糖(ECP-A1和ECP-A2),并测定其相对分子质量.用紫外光谱和红外光谱分析鉴定该多糖,紫外光谱分析未见蛋白质(280 nm)与核酸(260 nm)的特征吸收峰,红外光谱揭示ECP-A1具有典型的多糖特征吸收峰,表明ECP-A1和ECP-A2为单一均匀组分的多糖.     

牛地方性氟病的病因、发病机理及防治对策的研究

对宁夏青铜峡市黄牛地氟病的流行病学调查,证实黄牛有地方性氟病的流行。在检测机体内外环境氟含量的同时,对饮水、饲料、土壤和黄牛全血硒、铜含量测试发现：黄牛患有地氟病的同时,伴发亚临床的低硒和／或低铜血症。因此,确定其病的实质是高氟低硒低铜综合症。其病原是受生物地球化学特性的影响,通过水土食物链作用于动物机体而引致的多种微量元素营养代射失调,并有工业污染造成大气氟含量过高的协同因素。首次在生产条件下于高氟病区选定黄牛３２头,随机分为４组,每组８头：（１）高氟对照组;（２）高氟每日添加０２５ｍｇ·ｋｇ－１亚硒酸钠组;（３）高氟每日添加１５ｍｇ·ｋｇ－１硫酸铜组;（４）高氟每日添加０２５ｍｇ·ｋｇ－１亚硒酸钠＋１５ｍｇ·ｋｇ－１硫酸铜＋１ｍｇ·ｋｇ－１硫酸镁组。另于非病区选定黄、奶牛各８头做为正常对照组,分别于试验的第０ｄ,３０ｄ,８３ｄ采样分析,采用６×３析因实验设计和分组对比的方法,进行黄牛地氟病的毒理学研究。结果表明,①过量氟对非骨组织的血细胞产生毒害,使淋巴细胞转化率降低,约细胞膜Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰ酶活性受抑制;电镜扫描观察,见有大量红细胞变形,呈“棘球状”、“多角型或星芒状”,并引致免疫功能低下和造血工?     

亚临床型低血钙症奶牛生产性能及粪污排放特性

【目的】探讨亚临床低血钙症奶牛饲料采食量、泌乳量、粪尿排放量及粪污所产生污染气体排放特征的关系。【方法】黑龙江某集约化奶牛养殖场选取产后7—14 d年龄、体况、胎次相近的奶牛12头,根据血钙指标分为亚临床低血钙症组和健康组奶牛各6头,每头奶牛分别单独饲养,连续饲养4 d。每天采血检测血液中Ca、BHBA、NEFA、CLU、P、Mg指标含量;记录每头牛每天泌乳量、采食量、粪、尿排放量;通过简易动态箱法对试验奶牛粪尿进行混合,检测混合物产生的NH_3、CO_2、CH_4气体排放量并进行分析。【结果】亚临床低血钙症组奶牛血清Ca、P、Mg浓度极显著低于健康组奶牛(P0.01),CLU显著低于健康组(P0.05),BHBA浓度显著高于健康组(P0.05),NEFA浓度极显著高于健康组奶牛(P0.01);亚临床低血钙症组奶牛产奶量和4%能量校正乳(ECM)极显著高于健康组(P0.01),排粪量显著高于健康组(P0.05);干物质消化率和尿量的差异虽然不显著但都有升高趋势。亚临床低血钙组奶牛采食1 kg干物质的产奶量极显著升高(P0.01),采食1 kg干物质的排粪量显著升高(P0.05);健康组和亚临床低血钙症组奶牛CH4的排放曲线无明显差异,两组的产气趋势基本相同,于试验的52 h左右出现峰值,之后下降;总体上看CO_2的排放没有明显变化趋势,无明显规律,健康组和亚临床低血钙症组分别在48和36 h处出现排放高峰,亚临床低血钙症组出现峰值的时间要早于健康组,之后下降随即无规律起伏。亚临床低血钙症组的CO_2累计排放量随时间的推移低于健康组;健康组奶牛NH_3排放浓度在24h处出现高峰,随后降低,45 h再次出现峰值,之后排放浓度逐渐降低。亚临床低血钙症组奶牛NH_3排放浓度在21 h处出现峰值,之后排放浓度降低,两组试验的折线趋势基本一致,都是出现峰值后浓度降低但都是有起伏的波动。亚临床低血钙症组NH_3的累计排放量低于健康组。【结论】亚临床低血钙症奶牛患病期间由于采食摄取营养物质不能满足泌乳需求而处于能量及钙负平衡状态。同时肠道消化吸收率增加,用于满足泌乳对能量的需求;在相同质量的粪尿混合物检测情况下亚临床低血钙症不会影响CH_4的排放量,但亚临床低血钙奶牛粪尿中NH3和CO_2排放量低于健康牛,然而降低的温室气体排放是否与肠道消化吸收率的增加促进了饲料能量的吸收有关利用仍需进一步研究。     

离子交换色谱法对肌肉中钙激活酶分离纯化的研究

试验通过离子交换色谱法对肌肉中钙激活酶(Calpain)进行定量分析研究,确定了Calpain粗提液制备工艺。对Calpain粗提液进行全波长紫外扫描说明276～280nm处有一个吸收高峰。应用DEAE离子交换层析对Calpain进行纯化,用0～500mmol·L-1NaClTris-HCl进行离子强度线性梯度洗脱,在280nm波长下测定洗脱液的光吸收值,洗脱得3个蛋白峰,μ-Calpain和m-Calpain分别在NaCl为130～180mmol·L-1和260～300mmol·L-1时洗脱下来,钙激活酶抑制蛋白(Calpastatin)在NaCl为70～110mmol·L-1时洗脱下来。Calpain分子量为110000u,通过电泳试验表明,本检测结果提取液正好在分子量约为110000u处有一条清晰的带,说明所得提取物为Cal-pain,而且纯度较高。