育种方法发明专利保护范围——以侵害Bt+CpTI双价杀虫基因发明专利权案为例

正基本案情"两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合表达载体及其应用"技术是中国农业科学院生物技术研究所发明的育种方法专利,专利号为ZL98102885.3。该育种方法发明专利提供了全合成的编码苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的基因序列以及经过修饰的编码豇豆胰蛋白酶抑制剂的基因序列;包含所说两种基因序列的双价融合植物表达载体;这种载体导人植物后,可产生对昆虫表现有高抗虫性的转基因植物及其后代和种子,且昆虫不易对含有这     

优化的VHb基因和GFMcryIA基因构建的双价基因在烟草中的表达

利用人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得了36株卡那霉素抗性植株。经转基因植株的PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在35株烟草基因组中的整合。Western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验证实GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。且转基因烟草平均每株干重比非转基因烟草植株高7％。本研究结果表明转基因育种技术在培育出既高产又具抗虫性的作物或经济作物新品种方面具有良好的应用前景。     

新型Bt杀虫蛋白:VIP杀虫的机理与植物转基因应用

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中最主要是杀虫晶体蛋（insecticidal crystal proteins,ICP）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal protein,VIP）。VIP在励营养期生长阶段开始分泌,它们不形成蛋白晶体,和ICP在进化上没有同源性。VIP的杀虫活性很高,达到了纳克级水平,为一类新型杀虫蛋白,被认为是第二代生物杀虫剂。VIP根据蛋白质序列同源性主要分为三类：VIP1、VIP2和VIP3。VIP1和VIP2共同构成二元毒素对鞘翅目萤叶甲科昆虫具有特异性毒杀作用,VIP3对鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性。由于VIP对一些可能对ICP产生抗性的害虫具有高效的毒杀作用,而且害虫对ICP和VIP产生交互抗性的几率也很小,因此转VIP植物研究受到了科学家的青睐,并已有不少成功的报道和专利。目前为止,已经利用VIP3构建了转基因水稻、转基因玉米、转基因棉花等多种转基因作物。     

植物安全性表达载体的构建策略:以表达水稻反义蜡质基因的载体构建为例

基于转基因作物的安全性考虑,在用于转化的表达载体上除了含有目的基因以及控制该目的基因表达的启动子和终止子外,最好不存在其它有可能存在安全性争议的DNA序列,由此培育的转基因植物可能将更易于被消费者所接受。本研究以pCAMBIA1300载体为基础,基因操作去除pCAMBIA1300质粒上的潮霉素抗性基因和花椰菜花叶病毒的35S启动子序列,构建了两种只含有水稻蜡质基因启动子引导蜡质基因反义片段的表达载体,p13AWY-1和p13AWY-2。其中p13AWY-1表达载体含有一个由水稻蜡质基因启动子、第一内含子、反义蜡质基因（W axy pro＋intron1＋anti-W axy）的融合基因单元;而p13AWY-2表达载体含有两个正向排列的W axy pro＋intron1＋anti-W axy融合基因单元。我们通过构建水稻反义蜡质基因安全性表达载体,试图为植物安全性表达载体的构建提供一种思路,为今后大规模商业化采用转基因技术改良农作物遗传特性提供安全的转基因方法。     

转基因黑杨的抗虫性测定与分析

对大田移植的转基因杨树的PCR分析表明：5个转Bt单基因杨树无性系(FB40、FB45、FB56、FB59、FB60)和4个转双价基因(Bt和CpTI)杨树无性系(D9、D18、D27、D32)均检测到了Bt基因特异片段。在检测的12个转基因杨树无性系中，ELISA结果表明，转双价基因杨树无性系中以D18的Bt杀虫蛋白表达量最高，Bt杀虫蛋白含量达6754ng／g鲜叶，约占植物可溶性蛋白的0．090％；在转Bt单基因杨树无性系中以FB51表达量最高，达6796ng／g鲜叶，占植物可溶性蛋白的0．036％。     

Bt毒蛋白转基因植物的潜在问题及其研究对策

1 Bt毒蛋白转基因植物研究概述 Bt毒蛋白转基因植物的研究源于1981年Schnepf等人成功克隆Bt杀虫毒蛋白基因.1986年Obukowics等人采用转座子Tn5介导的方法,将cry1Ab基因引入植物的假单孢杆菌,使植物产生抗虫性,创造了第一代Bt转基因抗虫植物     

遗传转化植物中沉默基因的消除

随着基因技术在生物科学许多领域的深入开展,转基因沉默问题已引起越来越多的科技工作者的关注。大量转基因植物的研究证明许多因素与基因沉默有关,植物遗传转化中外源基因的整合具有很大的随机性,外源基因的沉默也表现出多种多样的形式,转基因生物的外源基因的沉默可由多种机理造成。外源基因以多拷贝整合到植物细胞基因组中,会发生失活;基因沉默与整合的位点也密切相关,如果整合到转录活跃的常染色体上,毗邻寄主基因的调控系统系列将会影响外源基因的表达;如果插入到重复DNA或异染色质区,外源基因可能会失活;基因沉默并非在每一个发育时期,每一个细胞中总发生,有的外源基因,在幼苗阶段表达是正常的,但萌发到一定阶段后基因表现沉默。转基因沉默通常分为两大类:一类是转录水平上的基因沉默,另一类是转录后的基因沉默。前者是发生在核内的时间,而后者是发生在细胞质中。两者都与甲基化有关,转录水平上的基因沉默主要发生在启动子区域,基因的转录受抑制;而在转录后的基因沉默中,甲基化主要发生在基因的编码区,基因能够转录,产生mRNA,但mRNA在细胞质中被特异性地降解,不能正常翻译成蛋白质造成的,转录后基因沉默发生在细胞质中,转录物能在细胞核中积累但在细胞质中mRNA迅速降解或不能正常地加工。二者在时间上并非简单的前后关系,在空间上也不因为核膜的存在而相互隔离。本文对转基因植物中外源基因沉默的机制,如何降低外源基因的沉默可能性,以提高外源基因的表达率,以及通过DNA糖基化酶等方法适当处理,激活已经沉默的基因等问题进行了评述。     

我国转基因植物研究硕果累累

<正> 近年来,我国转基因植物研究取得了突破性的进展。主要表现在以下几个方面: 转抗虫基因植物迄今研究得最多并取得成效的有两类基因,即苏云金杆茵的杀虫蛋白基因以及从豇豆等作物中分离的蛋白权衡利弊抑制荆基因,其中苏云金芽孢杆     

转细胞凋亡抑制基因OpIAP和p35增强小麦对纹枯病的抗性

Op IAP(Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein)是黄杉毒蛾核型多角体病毒中编码细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)的基因,p35基因编码苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒中具细胞凋亡抑制作用的35 k Da蛋白。本研究人工合成了Op IAP和p35基因,构建了同时含有Op IAP和p35表达盒的转双价基因载体p Ubi:p35-RSS1P:Myc-Op IAP,两基因分别由玉米泛素基因启动子(Ubiquitin,Ubi)和水稻蔗糖合酶-1启动子(sucrose synthase-1 promoter,RSS1P)驱动。通过基因枪介导法将该载体导入小麦品种扬麦16,获得双价转基因小麦。对T0~T2代植株,利用PCR、RT-PCR、q RT-PCR及Western blot分析,确认导入的外源Op IAP和p35基因能够在4个转双价基因小麦株系中遗传并表达。用来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌强致病株型R0301和WK207对转双价基因小麦的T1、T2代植株分别进行纹枯病抗性鉴定,结果表明,与受体扬麦16相比,双价转基因小麦的T1、T2代植株对纹枯病的抗性明显提高,说明Op IAP和p35基因的表达可以增强转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的抗性。     

抗虫棉生长发育过程中Bt杀虫基因及其表达的变化

目前已商品化生产的国内外抗虫棉品种在生产上均存在“苗期抗性强,后期抗性减弱”的现象。从DNA、mRNA和蛋白质3个水平上对双价抗虫棉139-20 R4代植株中Bt杀虫基因及其在整个生长发育期的时空表达进行了系统研究。研究结果表明,Bt杀虫基因在抗虫棉中的表达具有时空特异性。同一组织,Bt杀虫蛋白含量在整个生长发育期呈动态     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.     

利用可视化标记建立Cre-loxP介导的抗生素删除载体系统并应用于玉米转基因研究

本研究通过Cre-loxP系统,构建了Kan基因的删除载体系统,利用花青素合成途径中转录因子的表达指示删除的效果。首先,利用两次PCR方法对pGreen载体进行改造,在卡那霉素抗性(Kan)基因的两侧加入两个同向的loxP位点,在多克隆位点前插入5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的表达框作为筛选标记基因,命名为pBAC823。在此载体基础上,构建了两个植物表达载体,组成一个抗生素可删除的载体系统。其一是在pBAC823载体Kan基因的一侧加入花青素合成途径中两个转录因子bi基因和cl基因的表达框,命名为pBAC9008。该载体可以作为基础植物表达载体,用于表达目的基因。其二是含Cre酶基因表达框的植物表达载体。将hsp70启动子驱动的cre基因的表达框插入pBAC823载体Kan基因的一侧,并将玉米花青素基因合成途径中转录因子bi和cl的表达框插入多克隆位点,命名为pBAC9009,此载体作为一个删除载体,单独转化植物,之后可以通过杂交方法删除目的基因表达载体中两个loxP位点之间的Kan基因片段。将上述载体转化玉米幼胚,得到T0代转基因玉米的种子,其中部分籽粒为紫色,分子检测结果表明紫色籽粒有花青素基因的插入,验证了花青素合成基因作为可视化标记的可靠性。本研究采用了可视化标记跟踪外源基因的表达和抗生素抗性基因的删除,不仅大大降低了外源基因的检测成本,为转基因食品安全提供技术保证,在转基因研究中具有重要的意义。     

转Bt cry1Ah/2mG2-epsps双价基因抗虫/耐除草剂玉米研究

构建了含有Bt杀虫基因cry1Ah和耐草甘膦基因2mG2-epsps的双价植物表达载体pMAGUHM,通过基因枪轰击Q31×Z31杂交组合的胚性愈伤组织,以2mG2-epsps为筛选标记,通过1mmol/L草甘膦异丙胺盐筛选,获得T0代转化植株80株,其中PCR检测有36株为阳性植株,阳性率达45%。对得到的阳性植株的T1、T2代进行了跟踪检测,证明外源基因已整合到玉米基因组中并正确表达。草甘膦及玉米螟抗性检测结果表明,有5个转基因品系表现出具有耐草甘膦和抗虫的双重特性。     

转基因植物外源基因逃逸研究概述

转基因植物外源基因逃逸是伴随着转基因植物在环境中释放时潜在的一种风险。本文综述了转基因植物中外源基因逃逸的途径 ,重点介绍了几种转基因植物通过花粉在空间上逃逸的研究进展 ,文中还对影响转基因植物外源基因逃逸的因素进行了探讨。     

来自病原菌的蛋白质赋予烟草抗虫性

<正>嗜线虫致病杆菌是一种致病菌,可分泌名为XnGroEL的蛋白质,这种蛋白质对捕食性幼虫有害。食用杀虫蛋白XnGroEL,对棉铃虫而言有中毒效果,会导致幼虫的成长和发育终止。印度尼赫鲁大学的Punam Kumari和同事通过农杆菌介导转化得到了可表达该蛋白的转基因烟草植株,并测试出     

转GAFP-NPI基因香石竹

将双价抗病基因转入同一植物,是增强植物抗病性、拓宽抗病谱的有效措施.在建立香石竹叶片离体培养再生体系的基础上,将兔防御素基因(NP-I)和天麻毒蛋白基因(gastrodia antifungal protein,GaFP)构建在同一个植物表达载体pBin35SGAFP-NPI上,通过农杆菌介导法,利用香石竹叶片作外植体,将GAFP-NPI双价抗病基因导入香石竹品种Asso、Tuareg、ciao Bianco,经卡那霉素筛选共获得300余株转基因植株,并进行多重PCR检测,证明GAFP-NPI双价抗病基因已整合进香石竹的基因组中.琼脂糖孔隙扩散实验证明转基因香石竹对绿色木霉具有抑菌活性,说明了GAFP和NPI双价抗病基因在转基因植株中得到了表达.     

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含有bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白（CAVP）与兔防御素（hip-1）双价抗病基因植物表达载体（pBBSS—gafp-NPI—bar），受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定：首先，转化处理种子密播于塑料盘中，待小苗长到3叶期时，用浓度为120ms／L的Basra除草剂弥雾喷施筛选，     

转基因生物农药的安全性评价

生物农药即生物源农药,指来自于动物、植物或微生物,具有杀灭农业害虫天然活性的天然生物物质,它包括了植物即微生物的生物农药以及具有农药作用和抗农药作用的转基因作物。这些转基因植物的研究在世界范围内已经取得了令人瞩目的进展,针对这类抗虫转基因植物(Bt),在食品中的过敏性、毒性的安全性;植物生态的基因漂流、是否能诱发昆虫产生抗性和生物多样性的影响等的评价做简要的综述。     

转基因林木中安全标记基因的研究进展

近年来,林木转基因研究进展迅速。但是,由于基因工程技术中使用选择标记基因可能对生态、环境、非靶标生物等带来危害,标记基因的安全性问题已越来越受到人们的关注。据报道在基因工程研究特别是植物转基因研究中使用安全标记基因遗传转化系统方面已作了大量尝试。本文主要综述林木植物转基因研究中应用安全标记基因遗传转化系统的研究现状,重点介绍了正选择标记的使用,可重组系统去除标记基因,利用位点特异性重组去除叶绿体DNA中标记基因的叶绿体遗传转化表达载体系统,及未来基于高转化率和大量快捷PCR筛选的完全无选择标记基因的遗传转化体系等研究进展与应用前景。     

中国转基因植物的市场监管及法律保护

随着中国转基因技术和转基因植物市场的发展,对转基因植物的市场监管和法律保护提出了新的要求和挑战。本研究在分析中国转基因植物市场监管和法律保护现状的基础上,从监管措施、监管流程和效率、安全监管检测及评价标准、植物品种专利保护等方面指出现存的监管和保护问题,结合已有研究和政策条例,进一步提出有针对性的市场监管和法律保护制度完善建议,以期对中国转基因植物市场发展提供参考。