羊草CDPK1基因的克隆及序列分析

羊草是一种优质的天然牧草,对于盐碱胁迫有着很强的耐受性。本研究通过羊草(Leymus chinensis)EST(Expressed Sequence Tags, ESTs)序列和RACE(Rapid-amplification of cDNA Ends, RACE)技术,获得了LcCDPK1基因序列,通过生物信息学分析,得到LcCDPK1的全长基因,含1 599 bp的开放读码框(Open Reading Frame, ORF),编码含有532个氨基酸的不稳定弱酸性亲水蛋白质,同时对得到的LcCDPK1基因进行了进化分析。本研究有助于了解LcCDPK基因家族的功能,为进一步应用LcCDPK基因进行植物的耐盐碱性遗传改良奠定了基础。     

白羊草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

根据几种禾本科植物肌动蛋白基因的保守序列设计一对简并引物,以白羊草(Bothriochloa ischaemum)幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得一个肌动蛋白基因cDNA片段,命名为BiACT,该基因片段长度为720bp,编码240个氨基酸残基。氨基酸比对分析结果表明,BiACT基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。     

羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析

1材料与方法 1．1植物材料采摘自然生长于黑龙江省安达市（119°28’E,44°1’N）盐碱地的羊草叶片,-70℃冰箱保存。1．2总RNA的分离与eDNA文库的构建用液氮研磨叶片后,用TRIZOL Reagent（GIBCO BRL）提取总RNA,使用PolyATtract mRNA Isolation Systems（Promega）提取mRNA。然后采用Stratagene提供的cDNA合成体系合成cDNA,体外包装和扩增,构建羊草叶片的cDNA文库。     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

蕙兰Actin基因的克隆及序列分析

持家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参.为研究其他基因的调控机制或外源基因在蕙兰中的相对表达提供内参,根据GenBank已经登录的肌动蛋白(Actin)基因的同源核苷酸保守序列,设计简并引物,利用RT-PCR的方法,以蕙兰花蕾期的花葶为材料,克隆了4个Actin基因片段.序列分析结果表明,4个Actin基因片段长度均为1 062 bp,编码354个氨基酸,具有Actin基因的标记位点:肌动蛋白(YVGDEAQs.KRG和WISKaEYDE)和肌动蛋白类似物(LLTEApLNPkaNR).各片段之间同源性高达95.97％,经BLAST分析,与文心兰同源性可达94％.其氨基酸序列与萼脊兰(AED94091.1)和蝴蝶兰(AAF71265.1)同源性达99％.得到的4个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为CfACT1、CfACT2、CfACT3和CfACT5,并在GenBank注册,登录号分别为JN177718、JN177719、JN177720和JN177721.     

猪Tetherin基因的克隆及序列分析

为研究猪Tetherin基因的功能,应用RT-PCR手段从感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪肺脏组织扩增得到猪源Tetherin基因,将其克隆到p MD19-T载体并进行测序,采用分子生物学软件将其编码的蛋白质序列与其他来源的Tetherin蛋白序列进行比对分析,采用真核转染的方法研究其在MARC-145细胞中的定位情况。结果显示,克隆得到的猪源Tetherin基因全长534 bp;猪源Tetherin蛋白与牛、绵羊、猫、人、黑猩猩、猫头鹰、猕猴Tetherin蛋白同源性分别为41.5%、44.1%、42.3%、43.7%、45.4%、35.6%、42.1%;猪源Tetherin蛋白为跨膜蛋白,该蛋白定位在MARC-145细胞的细胞膜中。     

羊蹄GAPDH基因的克隆及序列分析

为利用实时荧光定量PCR技术研究中草药羊蹄有效化学成分合成相关基因表达情况,采用针对多糖、多酚植物样品的总RNA提取试剂提取高质量的羊蹄总RNA,随后运用反转录PCR方法克隆了羊蹄甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的部分c DNA序列,并以该序列为模板设计引物,采用实时荧光定量PCR验证其作为内源参照基因的可靠性。结果表明:获得的核酸序列长564 bp,编码188个氨基酸;推导的氨基酸序列与西伯利亚蓼、拟南芥、小麦GAPDH基因编码的氨基酸序列同源性分别为92%、90%和89%;扩增曲线和熔解曲线显示设计的引物可应用于实时荧光定量PCR扩增。羊蹄GAPDH基因的克隆为利用实时荧光定量PCR技术研究目的基因表达情况奠定了基础。     

樱桃CBF基因的克隆及序列分析

CBF(CRT/DRE-binding factor)基因是一种低温响应转录因子基因,CBF蛋白能够与很多低温相关基因的启动子结合,使其表达,从而增强植物抗冷能力。本研究利用已经公布的CBF序列的保守区设计特异引物,对樱桃砧木吉塞拉6号的cDNA进行扩增,成功获得CBF的全长序列。序列分析结果表明,其开放阅读框为723 bp,编码240个氨基酸,具有典型的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。氨基酸序列同源性分析表明,该CBF与蔷薇科植物同源性较高,与其他科属植物同源性较差。     

番茄雄性不育基因的克隆及序列分析

[目的]克隆番茄雄性不育基因,明确番茄雄性不育基因的突变信息.[方法]以番茄雄性不育系材料为试材,通过同源克隆的方法,将4个雄性不育的候选基因进行克隆.[结果]有3个候选基因在雄性不育系与可育系之间发生了突变,第一个突变基因Solycg001的序列全长为2473 bp,只在925 bp处发生了一个单位点突变,由G颠换为A;第二个基因Solycg 002的序列全场为4 288 bp,有3个位点发生了单位点突变,分别为1 194处C颠换为A、1 211处A颠换为G、1 529处T颠换为C;第三个突变基因Solycg 003的序列全长为3479 bp,有4个位点发生了单位点突变,分别为849 bp处T颠换为C、1 855处C颠换为A、1 877处插入了一个C和2 123处A颠换为G.通过生物信息学分析发现第一个基因Solycg001是一个剪切体蛋白基因;第二个基因Solycg002是一个淀粉与蔗糖代谢通路中的酶;第三个基因Solycg003是一个核糖体基因.[结论]根据前人研究的进展,植物的雄性不育是由于淀粉及可溶性糖的代谢异常引起的,初步判断第二个基因Solycg002为不育目标基因.     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

唐鱼生长激素基因的克隆及序列分析

[目的]为开展唐鱼转自源基因研究提供基本构架。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cD-NA序列,同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。[结果]序列分析表明:唐鱼GH cDNA的5非编码区为64bp,3非编码区为448 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,共编码210个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示,唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性,其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98%。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp,包括4个外显子和3个内含子,外显子大小分别150、117、162、204 bp;3个内含子都以GT开头、AG结尾,符合GT-AG法则。[结论]该研究为下一步构建自源GH基因构件,进行唐鱼的转自源GH基因研究,培育出生长快、体型大的唐鱼新品系奠定了基础。     

白桦MADS基因的克隆及序列分析

在分析了欧洲白桦MADS3与拟南芥AP1中的保守性后,设计了一对引物。以白桦雄花芽为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个MADS基因,其cDNA长738bp,包含了基因完整的编码序列,白桦MADS基因与已发表的欧洲白桦MADS3基因仅相差6个碱基,同源性高达99％;推导氨基酸序列的差异为5个,同源性达97％。分析其氨基酸序列表明,存在典型的MADS MEF2转录因子结构域和K-box结构域。     

太子参GAPDH基因的克隆及序列分析

为了获取可靠内参基因,采用同源克隆技术和c DNA末端快速延伸技术,首次从太子参中克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的部分c DNA序列,命名为Ph GAPDH,序列长度为981 bp,包含699 bp的部分阅读框,推测其编码232个氨基酸,还含有282 bp的3'UTR。序列分析结果表明,太子参Ph GAPDH基因编码的氨基酸序列与同科植物香石竹(Dianthus caryophyllus)氨基酸序列同源性高达99%。PCR分析结果表明,Ph GAPDH基因在太子参不同种源块根、同一种源不同组织及不同生长时期的表达水平较稳定,可以作为太子参功能基因研究的内部参考基因。     

人Neurturin基因的克隆及序列分析

文章以人胎脑cDNA为模板,采用巢式PCR方法扩增人Neurturin成熟蛋白基因,并将其插入到质粒pGEM-T,构建克隆载体pGEM-T-hNTN。对阳性重组子进行鉴定和序列测定,并与已克隆的人Artemin成熟蛋白基因进行同源性分析。结果表明,所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank NM004558)完全一致,人Neurturin成熟蛋白基因与Artemin同源性为58.5%。     

洋葱AcPME基因的克隆及序列分析

以洋葱花蕾为试材,通过RACE试验获得了Ac PME基因的全长c DNA序列,Gen Bank登录号为JF913196.1。该基因DNA序列包含2 786个碱基,4个外显子,3个内含子,c DNA序列长度为2 228 bp,编码序列长度为2 001 bp,编码666个氨基酸。生物信息学分析显示Ac PME蛋白存在明显的信号肽和跨膜区域(SP/TM)、PMEI结构域和PME结构域,在PME家族分类中属于第Ⅰ类,即含有一个长的N末端前区域(PRO-region)。氨基酸同源比对与系统进化分析表明,Ac PME蛋白与水稻、玉米、高粱等单子叶植物的同源蛋白具有较高的一致性。三维结构模式图显示该蛋白具有一个明显的凹沟,4个果胶结合位点氨基酸残基(T423、Q453、R565和W567),2个活性位点氨基酸残基(D476和D497)。本研究为洋葱Ac PME基因的结构域蛋白互作及功能研究奠定了基础。     

家蚕hop基因的克隆及序列分析

JAK激酶HOP是JAK/STAT信号途径的重要组成成员,在信号传导中发挥重要作用.为研究家蚕的JAK/STAT途径,通过RT-PCR克隆家蚕的hop基因(Bmhop)的cDNA,序列测定结果显示:Bmhop开放读码框为1 924 bp,编码638个氨基酸残基;结构分析结果显示:BmHOP具CRD_FZ、Kringle、转膜区域和PKc超家族蛋白激酶催化结构域TyrKc,每个结构域均可形成特定的三级结构;基于基因芯片的数据分析结果显示:Bmhop在家蚕5龄第3天的睾丸、卵巢、头部、脂肪体、中肠、马氏管中均有表达,但表达水平较低;基于TyrKc结构域序列的进化分析指出:昆虫HOP并不完全按物种聚类,BmHOP单独形成1个分枝,HOP在进化过程有TyrKc结构域扩增和TyrKc结构域组合事件发生.本研究结果为探讨BmHOP在JAK/STAT信号途径中的作用方式以及hop基因进化提供新的线索.     

文昌鸡PRL基因的克隆及序列分析

为研究文昌鸡催乳素基因的分子生物学特性和就巢机理,提取文昌鸡全血总DNA,利用特异性引物PCR技术获得文昌鸡PRL基因,将其克隆至pGM-T载体上,并测序分析.结果表明,文昌鸡PRL基因与GenBank 上已公布的白来航、泰和丝羽乌骨鸡核苷酸序列同源性分别为93.3%和93.5%,而氨基酸序列同源性均为89.6%;与其...     

牙鲆Mx基因的克隆及序列分析

对牙鲆(Paralichthys lethostigma)总RNA经反转录得到的cDNA测序。结果表明,获得的cDNA片段全长1 980 bp,其中编码区长1 890 bp,编码629个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为71.7 kDa。Blast比较以及Megalign软件分析的结果表明,此cDNA片段具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域;一个发动蛋白家族的典型结构特征序列及C端高度保守的Leu拉链结构区。进一步的序列比较与进化分析结果表明,牙鲆Mx基因与日本比目鱼等鱼类的同源性较高,同源性达75.1%-98.7%;而与哺乳动物的同源性相对较低,同源性达50.3%-55.1%。