黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ的亚细胞定位

基因枪法将经测序验证的黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ基因--EGFP融合表达载体导入洋葱表皮和黄瓜愈伤组织细胞,共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况.结果表明,该基因在包括液泡在内的整个细胞中均有表达.     

水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式

为了探明盐敏感相关基因[OsSsr1（Oryza sativa L.salt-sensitive related gene 1,GenBank登录号为NM₀01065574）]的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro数据库和Real-time PCR对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2 004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质,该蛋白质N端含有一个信号肽;其启动子序列包含TGACG-motif、ABRE、TCA-element和W box等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP融合表达显示,OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro数据库中数据分析表明,OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,胚中的表达量最低。Real-time PCR结果表明,OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA和ABA的诱导上调。这些结果显示,OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。     

植物β-半乳糖苷酶研究进展

植物β-半乳糖苷酶是一类糖苷水解酶,能够从β-D-半乳聚糖或寡聚糖支链非还原末端切除β-D-半乳糖残基。β-半乳糖苷酶广泛分布于各种植物中,通过对细胞壁的重塑参与植物生长发育过程。总结了植物β-半乳糖苷酶生化与分子生物学方面的最新研究进展,并就其结构域及催化机制、生化特性、亚细胞定位和表达模式、生理功能等方面展开详述。     

水稻硫转运蛋白基因OsST的亚细胞定位

[目的]构建水稻硫酸根转运基因OsST与YFP黄色荧光蛋白融合表达载体,对OsST蛋白进行亚细胞定位。[方法]从水稻叶片的cDNA中克隆OsST基因ORF全长,测序验证后连入pAT—YFP表达载体,通过基因枪将融合栽体转入洋葱上表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中荧光发光部位。[结果]OsST蛋白定位于细胞膜和核膜上。[结论]为进一步研究硫转运蛋白的功能及硫酸根运输的机理奠定了基础。     

水稻抗白叶枯病相关基因的亚细胞定位

利用亚细胞定位技术对水稻抗白叶枯病相关基因的表达产物进行了分析,为基因功能分析提供了重要信息。通过前期基因芯片筛选、半定量/定量PCR的验证及基因功能注释,从高抗白叶枯病水稻品种Y73中筛选了18个潜在的与抗白叶枯病相关的基因,并在烟草叶片细胞中进行亚细胞定位分析。通过观察融合有绿色荧光标记(sGFP)的表达产物,初步了解这些基因在烟草细胞中的表达位置。经过激光共聚焦显微镜观察后发现: 其中4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞核上,可能发挥了转录因子的功能;4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞质膜上,推测可能与细胞质膜的稳定或控制蛋白转运相关;4个基因的 sGFP 融合蛋白同时定位于细胞核和细胞质膜上;另有6个基因的 sGFP 融合表达后没有观察到明显的定位信号。     

水稻Ossp1基因的亚细胞定位及其干旱条件下的表达

sp1基因是叶绿体蛋白质输入调控的关键基因,本研究通过生物信息学分析、Real time PCR分析、瞬时表达分析等方法,对sp1在水稻中的同源基因Ossp1进行了结构和功能预测、组织表达和干旱响应性分析以及亚细胞定位分析。生物信息学分析结果显示,水稻Ossp1基因位于7号染色体,基因登录号为Os07g0647800,序列全长1 032 bp,SP1蛋白由343个氨基酸残基组成,信号肽序列位于氮端,蛋白质分子中有2个跨膜区域。Real time PCR分析结果显示,Ossp1在水稻叶片中表达量最高,其次为叶鞘,根中最低,此外,Ossp1在叶片中的表达具有明显的干旱响应性,受到干旱胁迫诱导后,表达量显著提高。采用瞬时表达进行亚细胞定位结果显示,SP1蛋白定位于水稻叶绿体。上述结果显示了Ossp1基因与水稻叶绿体及干旱胁迫响应的关系,为Ossp1基因功能的深入研究提供了基础。     

水稻OsNHX5基因的亚细胞定位及表达分析

采用PCR方法从水稻中克隆出1个Na~+/H~+逆转运蛋白基因OsNHX5,构建了该基因的亚细胞定位表达载体,利用注射烟草法对OsNHX5进行亚细胞定位,利用荧光定量PCR技术研究OsNHX5基因在盐胁迫下的表达模式。结果表明,OsNHX5与拟南芥AtNHX5和AtNHX6的亲缘关系较近,该蛋白定位于细胞内膜系统上;荧光定量PCR结果表明,叶中OsNHX5基因的表达受KCl胁迫诱导上调表达,而根中OsNHX5基因的表达变化不明显。OsNHX5是一个细胞内膜系统上的K~+/H~+逆转运蛋白,可为耐盐水稻的分子育种提供理论依据。     

水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位研究

[目的]探讨水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位。[方法]克隆了水稻中的重要通道蛋白OsPIP2—6基因,构建了瞬时表达载体,通过基因枪法在洋葱表皮中进行瞬时表达,并通过激光共聚焦显微镜进行了观察。[结果]水稻水通道蛋白OsPIP2-6主要定位在细胞质膜上,证明了OsPIP2-6是个水通道蛋白。[结论]为植物水通道蛋白的深入研究提供了理论依据。     

不同水稻品种OsVDAC8的表达模式比较与亚细胞定位分析

[目的]研究OsVDAC8的理化性质和表达模式,为探究OsVDAC8的功能提供基础。[方法]用生物信息学分析OsVDAC8的结构特征及表达谱,然后通过定量PCR对3个不同水稻品种日本晴(NIP)、粤泰A(YTA)、粤泰B(YTB)不同发育时期的不同组织中OsVDAC8的表达模式进行分析,并通过BiFC对亚细胞定位进行验证。[结果]OsVDAC8编码区全长1 014 bp,编码337 aa,生物信息学分析结果显示,OsVDAC8是具有1个结构域的稳定的定位于线粒体的亲水蛋白,通过11次跨膜形成特异的桶状结构。在ATG上游含有13个与水稻生长发育及胁迫应答相关的顺式作用元件。RiceXPro和MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表达数据库分析结果表明,NIP中OsVDAC8在生殖生长期的茎和花序出现前后幼穗中表达水平最高,在胚乳和根中的表达量较低。对NIP、YTA、YTB 3个水稻品种中OsVDAC8的表达谱分析结果显示,OsVDAC8在3个水稻品种四叶期的叶鞘表达水平都非常高,在花粉内容物充实期都很低,但幼穗发育的不同时期3个品种中表达水平差异很大...     

水稻Os09g29390基因冷胁迫表达模式及亚细胞定位分析

为了研究水稻Os09g29390基因在冷胁迫条件下的功能,以水稻苗期冷胁迫基因表达谱芯片中编码水稻质体蓝素类蛋白(Plastocyanin like protein)的下调表达基因Os09g29390为研究对象,对Os09g29390基因进行冷胁迫下表达特性分析、同源性分析及亚细胞定位分析.结果表明,Os09g29390基因在冷胁迫处理下表现为下调表达模式;氨基酸相似性分析与保守结构域分析显示,Os09g29390基因与其同源基因的氨基酸编码序列具有一个保守的铜结合位点;将Os09g29390基因与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合,转化烟草原生质体,结果Os09g29390基因定位于细胞叶绿体中.以上结果初步阐明该基因在冷胁迫下的表达特性及作用位点,为以后更深入的研究该基因的功能提供了指导.     

水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位研究（摘要）

[目的]探讨水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位。[方法]克隆了水稻中的重要通道蛋白OsPIP2-6基因,构建了瞬时表达载体,通过基因枪法在洋葱表皮中进行瞬时表达,并通过激光共聚焦显微镜进行了观察。[结果]水稻水通道蛋白OsPIP2-6主要定位在细胞质膜上,证明了OsPIP2-6是个水通道蛋白。[结论]为植物水通道蛋白的深入研究提供了理论依据。     

烟草DXS基因的克隆及其亚细胞定位分析

[目的]从烟草cDNA中扩增出1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因(去除终止密码子TAA),并对其进行亚细胞定位分析。[方法]利用RT-PCR技术分离、克隆DXS,将烟草DXS基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组构建亚细胞定位表达载体,转入根癌农杆菌LBA4404后注射侵染本氏烟烟草幼苗进行瞬时表达;并利用激光共聚焦扫描显微镜观察转GFP植株的表达情况。[结果]显微镜观察发现,DXS和GFP融合蛋白仅在本氏烟叶肉细胞(尤其是保卫细胞)的叶绿体中产生绿色荧光,DXS基因在叶绿体中特异表达。[结论]DXS定位在叶绿体中,为接下来对DXS基因功能研究提供了理论依据。     

野大麦CIPK基因的亚细胞定位

为明确野大麦CIPK基因在植物亚细胞水平上的定位情况,以已知细胞质膜定位的拟南芥AtCBL1基因和液泡膜定位的AtCBL3基因作为参照,构建了这两个基因分别与红色荧光蛋白基因（RFP）融合的植物表达载体（参照载体）,以及野大麦CIPK基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合的植物表达载体（目标载体）,利用基因枪转化法将参照载体和目标载体共转化洋葱上表皮细胞,瞬时表达后利用激光共聚焦显微镜进行共定位分析。结果表明,该基因主要定位于细胞膜和细胞核,为进一步深入分析该基因的功能提供了重要依据。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

油茶CoFAD2-1基因的克隆、亚细胞定位及组织表达

【目的】克隆油茶CoFAD2-1基因,并进行亚细胞定位和组织表达研究。【方法】采用CTAB法提取油茶4种组织中的总RNA;运用RT-PCR方法,设计基因特异性引物,从油茶未成熟胚中克隆CoFAD2-1基因;用生物信息学手段分析了CoFAD2-1基因的结构和进化关系;利用实时荧光定量PCR技术研究CoFAD2-1基因在不同组织的表达;同时运用烟草瞬时表达技术对该基因进行亚细胞定位分析。【结果】该基因编码区全长为1 149 bp,共编码382个氨基酸,具有FAD2基因家族保守的3个组氨酸簇。系统树分析显示该基因与种子特异表达的FAD2基因聚在一起,组织表达分析也表明CoFAD2在种子中特异表达,转化烟草叶片验证CoFAD2-1蛋白定位于内质网膜上。【结论】CoFAD2-1基因在种子中特异性表达,且定位在内质网膜上。     

拟南芥AGO2的亚细胞定位分析

Argonaute(AGO)是一类高度保守的蛋白,对基因沉默和植物抗病性起重要调控作用。为进一步了解AGO作用机制,今采用生物信息学技术对拟南芥AGO蛋白各成员的细胞定位进行预测,并对AtAGO2进行亚细胞定位分析。10个拟南芥AGO蛋白均不含信号肽序列,表明它们不是外泌蛋白。AtAGO1,AtAGO2,AtAGO3,AtAGO4和AtAGO9带有核定位信号,但携带的核定位信号肽序列各不相同,显示这些AGO蛋白可能定位于细胞核。通过克隆AtAGO2全长序列,构建获得与报告基因eGFP融合表达的细胞定位检测载体pCHF3-eGFP∷AtAGO2,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中,激光共聚焦显微镜观察结果表明,AtAGO2蛋白定位于细胞质和细胞核中。茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理诱导AtAGO2蛋白在细胞质膜及其周围"颗粒化"聚集,但抗病诱导剂苯并噻二唑(benzothiodiazole,BTH)处理不影响AtAGO2蛋白的亚细胞定位。这些结果说明AtAGO2可能通过JA途径参与植物抗病性的调控。     

枯草芽孢杆菌AmyX基因信号肽性能优化研究

从枯草芽孢杆菌1A 747菌株基因组克隆Am yX基因信号肽序列,构建枯草芽孢杆菌分泌表达载体pYGAm yX,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGAm yX)。采用重叠PCR技术,将Am yX基因信号肽突变,使其N端正电荷增加,H区疏水性降低,利用突变后信号肽序列构建枯草杆菌分泌表达载体pYGMUT,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGMUT)。对W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT)的表达产物进行检测,研究Am yX基因信号肽突变对枯草杆菌蛋白分泌途径的影响。结果表明,W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT均能表达β-半乳糖苷酶,W B 700(pYGAm yX)的最高胞外酶活性达2 300 U,W B 700(pYGMUT)的最高酶活性达5 200 U。结果表明Am yX基因信号肽突变后构建的表达载体pYGMUT分泌表达β-半乳糖苷酶明显提高,说明β-半乳糖苷酶通过枯草杆菌T at途径分泌表达。     

番木瓜PL和β-Gal基因双价反义表达载体的构建

在已报道的番木瓜果胶裂解酶(PL)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因序列的基础上,设计特异引物,分别扩增保守区序列,将其分别反向插入植物表达载体pCAMB IA1301-35S-GUS-Nos的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建反义表达载体pCP和pCG.然后用2种不同的方法将带有完整启动子和终止子的PL和-βGal基因引入pCAMB IA2301中,获得PL和β-Gal基因的双价植物反义表达载体pCPG,并对2种方法进行比较.     

培养基组分对水稻源Globotriose合成酶异源表达的影响

Globotriose是一种具有重要生理功能的α-低聚半乳糖,难以从天然产物中直接提取,酶法合成是主要的制备方式.水稻源GH36族α-半乳糖苷酶具有一步合成Globotriose的能力,但该酶在重组大肠杆菌中表达量和酶活力较低.为进一步提高酶蛋白的表达,以酶活力、菌体质量以及总酶活力为指标,研究LB、SOB、SOC、S...