Cry1Ia蛋白的表达与纯化

苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为便于后期评价不同的Cry1Ia蛋白,建立了Cry1Ia蛋白的表达与纯化体系。将一个cry1Ia基因的编码基因接入pET28aDel表达载体,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)star菌株。在大肠杆菌中诱导Cry1Ia蛋白的表达,并与Bt中的表达产物进行比较。最后,利用Cry1Ia蛋白C端包含的组氨酸标签,对大肠杆菌表达的Cry1Ia蛋白进行纯化。结果显示,大肠杆菌中Cry1Ia蛋白随着表达时间的延长,产物积累显著,并且其表达量高于Bt菌株,因此,其更适宜生产完整的Cry1Ia蛋白。对大肠杆菌表达的Cry1Ia进行纯化,获得了理想的结果。研究构建了Cry1Ia蛋白的大肠杆菌表达体系,并成功对其进行纯化,可为进一步研究此类蛋白的杀虫活性和机制奠定基础。     

Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达

[目的]苏云金芽孢杆菌表达的杀虫蛋白Cry1Ia和Cry2Ab对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为充分利用已有Cry蛋白,本文构建了两者的融合蛋白,并对融合蛋白的原核表达进行检测。[方法]本文将两个基因的编码基因,按照两种先后顺序拼接起来,获得cry1Ia-cry2Ab融合基因和cry2Ab-cry1Ia融合基因。另外,将Cry1Ia蛋白N端第一个α-螺旋(73个氨基酸)的编码序列删除后,接入cry2Ab基因5'端,获得第三个融合基因cry1IaD73-cry2Ab。将3个基因分别插入pHT304载体,并由cry1Ac基因的启动子和终止子调控其在Bt细胞中表达。[结果]SDS-PAGE结果显示,Cry1Ia-Cry2Ab、Cry2Ab-Cry1Ia和Cry1IaD73-Cry2Ab三个融合蛋白均能够在Bt细胞中表达,其测定分子量与预期大小一致,分别约152kDa、152kDa和144kDa。蛋白印迹法分析发现,在表达过程中,三种融合蛋白均有一定比例的降解。另外,不同温度对融合蛋白的表达也有不同程度的影响。[结论]本研究构建了3种融合杀虫基因并在Bt细胞中成功表达,为进一步解析这类融合蛋白的杀虫活性和机理奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,Western blot鉴定回收产物.结果表明,IPTG浓度为0.50 mmol/L、27℃诱导4h时Cry2Aa蛋白表达量最高,SDS-PAGE胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法.     

棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry1Ac毒力的影响

【目的】 研究棉铃虫（Helicoverpa armigera）中肠蛋白ABCC1（HaABCC1）与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】 分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系（96S）和Cry1Ac抗性品系（BtR）棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】 HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系（BtR）与敏感品系（96S）棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】 HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究

 通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析，以及与已知Cry蛋白比较，设计了6对特异性引物，PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上，导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性，研究结果表明含有第1-685位和含有第22-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性，与全长Cry1Ba3蛋白相比，没有改变；含有第54-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低；而含有第22-627位和含有第85-655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的最小活性区在第22-655位氨基酸之间。     

一种纯化苏云金杆菌Cry1Ac蛋白的方法

Cry蛋白的纯化技术在很大程度上制约了其结构与功能的研究.为此,提出了一种以等电点沉淀方法纯化苏云金杆菌Cry1Ac的原毒素,用分子筛层析纯化其活性毒素的方法.结果表明:Cry1Ac的原毒素在pH值5.05条件下沉淀纯化效果好;以纯化的原毒素激活进行分子筛层析,收集其最大峰便可获得较高浓度的活性毒素;该方法不仅纯化效果...     

苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白cry2Ad2原核表达及其不同长度片段产物的杀虫活性

该研究采用NCBI蛋白分析软件对Cry2Ad2蛋白序列进行分析,采用PCR克隆获得3种不同长度的cry2Ad2及全长cry2A d2基因片段,并将这些基因片段克隆到pET-26b载体上,构建重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3,再导人大肠杆菌BL21(DE3)中进行细胞周质诱导表达,并采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾的毒力.Cry2Ad2蛋白的序列分析结果表明:全长的Cry2Ad2蛋白包含两个保守区域domain I(第53位～第264位氨基酸)和domainⅡ(第267位～第472位氨基酸),推测保守活性片段C端末端在N-端的第472位与第633位氨基酸之间.重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3在大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳验证分别含有约70000、52000、51000和54000的表达蛋白.生物活性初步测定结果表明:表达的Cry2Ad2、Cry2Ad2-1、Cry2Ad2-2及Cry2Ad2-3给药72h后对小菜蛾都具有杀虫活性,其中蛋白Cry2Ad2、Cry2Ad2-2与Cry2Ad2-3对小菜蛾有较强的毒性,相同剂量致死率分别为64.35％、53.27％和61.66％,统计分析表明蛋白Cry2Ad2-1与Cry2Ad2-3的致死率与蛋白Cry2Ad2的致死率无显著差异,(P＞0.05);蛋白Cry2Ad2-2对小菜蛾的毒力相对较低,相同剂量致死率为39.89％,蛋白Cry2Ad2-2的致死率与蛋白Cry2Ad2的致死率差异显著(P＜0.05).鉴此,初步推断Cry2Ad2蛋白对小菜蛾的活性区在第49位与第463位氨基酸之间.     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因的克隆及原核表达

[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因序列。[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Ac基因的重组质粒pUCLy1Ac。[结果]cry1Ac基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cry1Ac3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134 kD蛋白带。[结论]诱导表达的cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常规对照品系(苏棉12)不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量.结果表明,两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势,花铃期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为4.43和2.93 μg·g-1)和吐絮期(3.87和2.86 μg·g-1)的含量分别降至苗期第6叶(7.64和8.38 μg·g-1)的58%、35%和51%、34%;相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶,前两者均为后两者的两倍以上.     

Mtx1和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展

球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericuss,Bs)Mtx1和苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis israelens,Bti)Cry4Ba是主要的杀蚊毒蛋白。通过对Mtx1毒蛋白杀蚊的作用机理,Cry4Ba毒蛋白的结构与作用机理的介绍,综述Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白基因工程研究进展,并对Mtx1毒蛋白和Cry4Ba毒蛋白的未来研究进行了思考。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac28基因的克隆及原核表达

研究旨在克隆苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Q-12的cry1Ac28基因并在原核载体中表达。应用PCR-RFLP法鉴定出Bt Q-12中含有cry1Ac基因,根据已知的cry1Ac全长基因序列设计特异引物,以Bt Q-12基因组DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pEB相连接获得含有cry1Ac全长基因的重组质粒pEB-cry1Ac,经过序列分析表明,该基因编码区为3 537 bp,编码1 178个氨基酸,分子质量为133.3176 ku,pI为4.885,为弱酸性蛋白质,亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)三种氨基酸含量最高,分别为8.06%、7.80%、7.72%,该基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株能够正常表达133.3176 ku蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank中登录,登录号为FJ610439,并由Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ac28。为进一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下了良好的基础。     

原核表达获得Tizip1蛋白

将谷子中的Tizip1基因克隆到原核表达载体pEX-2T中，并使此克隆表达载体在BL21（DE3）宿主菌中表达；用IPTG诱导Tizip1蛋白的表达．结果表明：在30℃利用1mM的IPTG诱导5h可以获得高效的表达产物．     

苏云金杆菌Cry1C毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育存活及取食行？…

研究了苏云金杆菌Ｃｒｙ１Ｃ毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及了食行为的影响,结果表明,当饲料中所含毒素浓度增高时,幼虫历期延长、存活率降低,对饲料的拒食作用和选择作用增强,取食量和生长量减少,在毒素浓度相同的情况下,敏感品系相比,抗性品系对含有毒素的饲料明显具有较强的适应能力。     

新Cry1B蛋白基因的筛选与鉴定

[目的]Cry1B类杀虫蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性,具有广阔的应用前景。为进一步挖掘并研究Cry1B类蛋白。[方法]本文使用一对引物对24个Bt菌株进行定性PCR反应,尝试筛选新的cry1B基因。该引物能够扩增包括Cry1B蛋白N-端3个结构域在内的718个氨基酸编码序列。[结果]共有8个菌株包含cry1B基因,约占筛选菌株的33.3%。序列分析发现,获得8个基因中有6个为新基因,其中6-1和15-1基因编码氨基酸序列与Cry1Bd1完全相同;9-1、10-1、18-1、20-1和21-1对应氨基酸序列与Cry1Bd1的一致性≥98.5%;而4-1基因编码的氨基酸序列与Cry1Bb1和Cry1Bc1蛋白N-端仅差1个氨基酸,需要进一步鉴定C-端长尾的编码序列以判断其所属亚类。[结论]本研究获得6种新型Cry1B蛋白基因,为进一步解析这类蛋白的杀虫活性和机理提供了丰富的材料。     

Cry1Ia和Cry2Ab杂交分子的构建和表达

同源性较低的Cry杀虫蛋白之间的结构域交换突变体成功案例很少。选择2种氨基酸同源性很低且蛋白其他特点差异也较大的Cry2Ab和Cry1Ia为亲本,将它们的3个结构域(Domain I,II和III)互换,构建6种结构域交换突变体。将这些突变体在Bt菌株中表达,分析其表达稳定性,并比较不同温度条件下的表达情况。结果显示,6种突变体在28.5,32.0℃条件下,均能够稳定表达,且表达量较高。说明构建的6种突变体在Bt菌株中具有较好的表达稳定性,以此为基础可以进一步检测其杀虫活性等特性。     

广谱高效Bt菌株的筛选及其杀虫蛋白基因的克隆

通过杀虫活性测定,获得1株对菜青虫、小菜蛾、二化螟等多种鳞翅目害虫均有较高杀虫活性的高效苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）菌株,命名为X-2．同时根据Cryl类蛋白N端部分氨基酸序列设计了1对简并引物,以苏云金芽孢杆菌X-2菌株质粒DNA为模板,应用PCR扩增技术得到一大小为3468bp的DNA片段（Cry1Ab X-2）．该基因编码1155个氨基酸,相对分子质量为130780,等电点pI=5．06．序列比较表明该基因与Cry1Ab类基因高度同源（达95％以上）,该基因已在GenBank中登录,登录号为AY847289．     

苏云金杆菌Cry1C毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及取食行为的影响

研究了苏云金杆菌Ｃｒｙ１Ｃ毒素对甜菜夜蛾幼虫生长发育、存活及取食行为的影响．结果表明,当饲料中所含毒素浓度增高时,幼虫历期延长,存活率降低,对饲料的拒食作用和选择作用增强,取食量和生长量减少．在毒素浓度相同的情况下,与敏感品系相比,抗性品系对含有毒素的饲料明显具有较强的适应能力．     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。