番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子,参与基因的表达调控,与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。以拟南芥AtROS1基因为目的基因,采用“酶切-连接”的方法构建了以17 β 雌二醇为诱导剂的植物表达载体pER8 ROS1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。qPCR结果表明：17 β 雌二醇处理能够有效调控pER8 ROS1中目的基因的表达,17 β 雌二醇最佳诱导浓度为50～100 μmol·L-1;随着诱导时间的延长,目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高。该诱导表达载体的构建为研究植物抗逆胁迫过程中的表观遗传机制奠定了基础。     

桃果实番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

以黄肉品种桃果实‘金丽’为试验材料,利用同源序列克隆技术获得桃果实番茄红素β-环化酶(LCYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpLCYb。PpLCYb全长1 699bp,编码区长度1 515bp,编码504个氨基酸。进化树分析发现PpLCYb与草莓FaLCYb亲缘性较高。氨基酸序列分析表明PpLCYb含有特征序列LYAMPF及NAD(P)/FAD结合区,属于SDR超级家族。实时荧光定量PCR结果显示PpLCYb基因在桃果实中的表达总体呈现上升的趋势,并在果实处于硬熟期时达到较大值,随后在完熟期略有下降。桃果实PpLCYb基因的克隆及表达分析可为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机制奠定良好的基础。     

杜氏盐藻LYCB基因克隆及在盐胁迫下的表达分析

[目的]为探究杜氏盐藻(Dunaliella Salina)富集β-胡萝卜素的分子机理。[方法]本文选用从运城盐湖分离的杜氏盐藻株系Ds-YC011为试材,克隆编码番茄红素-β-环化酶(lycopene b-cyclase,LYCB)的基因(DsLYCB)并分析其功能。[结果]DsLYCB基因cDNA全长1 910bp,开放阅读框(ORF)长1 769bp,编码584个氨基酸。生物信息学分析显示,DsLYCB为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构,定位于叶绿体。蛋白二级结构中α-螺旋结构占39.9%,杜氏盐藻DsLYCB蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,在高盐(3mol·L~(-1))胁迫下,DsLYCB基因表达量显著上升,胁迫4h时表达量达峰值,为正常对照(1.5mol·L~(-1))条件下的2倍。高盐(3mol·L~(-1))胁迫下,DsLYCB基因上调表达模式与藻细胞类β-胡萝卜素积累增加相一致,预示着DsLYCB在杜氏盐藻类β-胡萝卜素合成积累中起重要作用。[结论]这为解析微藻类胡萝卜素合成调控机制及遗传修饰提供了科学依据。     

万寿菊番茄红素β-环化酶基因及其启动子克隆和功能分析

【目的】克隆万寿菊番茄红素β-环化酶基因和其启动子,进行生物学信息分析,并预测启动子功能,为万寿菊类胡萝卜素的代谢机制和叶黄素含量的调控提供参考依据。【方法】通过RT-PCR技术从万寿菊总RNA中克隆得到TeLCYb的cDNA序列;应用生物学方法分析其DNA序列及其编码蛋白质序列特征,使用DNAMAN和在线软件Box Shade对其氨基酸序列同源性比对分析,并利用MEGA6.0构建进化树,分析其亲缘关系;根据其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其启动子序列,利用Plant Care在线数据库分析万寿菊TeLCYb启动子调控元件,构建启动子缺失表达载体pTeLCYb(-1969)∷GUS和pTeLCYb(-1140)∷GUS,利用农杆菌介导法侵染烟草,以GUS为报告基因研究不同调控元件的活性。【结果】从万寿菊中成功克隆TeLCYb,生物信息学分析发现,其全长共1 865 bp,开放阅读框为1 527 bp,编码508个氨基酸,氨基酸序列同源比对结果表明其与西洋蒲公英和菊花的同源性最高,且具有LCYb蛋白质特有的保守功能位点和特征多肽序列,在进化上与菊科单独聚为一枝。在已知基因序列的基础上获得长度为1 806 bp的TeLCYb启动子序列,生物学信息分析表明:该启动子除包含核心启动子元件TATA-box、CAAT-box外,还含有多种光应答元件和激素响应元件,其中光响应元件有13个,激素响应元件有5个,此外还具有MYBHv1结合位点元件、耐热响应元件、生理调控作用元件等顺式调控元件。GUS化学组织染色结果显示不同长度启动子均能够驱动GUS在茎、叶、花药及柱头中表达,但不同组织GUS染色蓝色斑点深度不同,其中花器官中花药和柱头中GUS酶活性最强;相对于启动子pTeLCYb(-1969),pTeLCYb(-1140)启动子还能够驱动GUS在根、叶和花萼中特异性表达,且各组织中GUS酶活性明显强于启动子pTeLCYb(-1969)的GUS化学组织染色结果。【结论】不同长度TeLCYb启动子均能驱动下游GUS的表达,但启动子的作用部位和作用强度存在差异,推测在ATG上游1 140 bp和164 bp区间的光响应元件可能具有增强子的功能,而全长启动子特有的激素响应元件和热响应元件可能具有抑制或降低启动子功能的作用。     

伪狂犬病毒基因转移载体的快速构建及其瞬时表达

以含有伪狂犬病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｕｓ,ＰＲＶ）蛋白激酶（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ,ＰＫ）基因的重组质粒为基础,利用非互补粘性经过部分补平后成为粘性末端,再进行连接的方法克隆了与载体分子大小相当的报告基因表达盒。用限制发现人切酶分析确证了伪狂现毒表达载体中报宽大圊窝囊斩主方向,并通过导入细胞后检测外源基因在体外的瞬时表达,直接鉴定一表达载体的生物学活性。     

谷子类胡萝卜素生物合成途径中番茄红素β-环化酶基因的克隆

利用降落PCR的方法。从谷子基因组中获得lcy-b基因。全序列分析表明。其开放阅读框为1782bp，编码的蛋白由594个氨基酸组成。分子质量为67724u。将获得的谷子lcy-b基因序列与已发表的其他植物lcy-b基因序列比较。发现所得到的基因序列与单子叶植物黄水仙的同源性明显高于与双子叶植物的同源性。蛋白质序列比较发现中部和尾部的部分区段内氨基酸同源性较高，且都存在FLYAMP序列和FAD／NAD(P)结合区等植物LCY—B的特征序列。Southern杂交结果表明。lyc-b在基因组中以单拷贝存在。     

杜氏盐藻基因DsSP的克隆、分析和原核表达(英文)

[目的]克隆盐藻淀粉磷酸化酶基因,并初步分析其基本性质和表达蛋白。[方法]采用RT-PCR和RACE的方法克隆基因;生物信息学系统分析其性质;构建原核表达载PGS21a-DsSP转化于E.coli BL21表达蛋白,采用GST-SefinoseTMKit和Western Blot分别纯化、检测该融合蛋白。[结果]成功克隆出1种淀粉磷酸化酶(GenBank accession No.KF061044)命名为DsSP;分析得到了其基本性质并预测了该蛋白的亚细胞定位、二级结构和三级结构;该融合蛋白在上清和包涵体中均存在,且对上清蛋白成功纯化;Western Blot检测表明其在E.coli.BL21中成功表达。[结论]为进一步阐明DsSP的功能及作用机制奠定了理论基础。     

蚓激酶基因乳腺表达载体构建及在牛乳腺中的瞬时表达

在稀有密码子的改造基础上,人工合成了849 bp的蚓激酶F-Ⅲ-1全长cDNA序列,并以其为目的基因,构建了以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和pLN-bCP-LK。2种质粒分别以200,500,1 000,2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,以纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测该基因表达后奶样的纤溶活性。结果表明:注射后3~78 h,奶样有明显纤溶活性,其中6~16 h活性最高。500μg pBLK质粒与其他3个剂量溶圈直径之间差异显著(P<0.05),而其他3个剂量之间差异不显著;pLN-bCP-LK质粒的各剂量溶圈直径之间差异均不显著,且2种质粒的同剂量溶圈直径之间差异也不显著。以上结果表明,改造后的蚓激酶基因可以在泌乳期黑白花奶牛乳腺中实现瞬时表达,以500μg的注射剂量表达效果最佳。     

杜氏盐藻DsFAD2基因的鉴定及缺氮胁迫下表达分析

[目的]w-6脂肪酸去饱和酶2(FAD2)催化油酸(18∶1)去饱和形成亚油酸(18∶2),是多不饱和脂肪酸合成过程中的第一个关键酶。为了探究DsFAD2在盐藻油脂合成积累中的作用。[方法]本文以运城盐湖分离的富油杜氏盐藻(Dunaliella salina)株系(YC-011)为材料,利用高保真PCR技术克隆盐藻DsFAD2基因,并对DsFAD2编码蛋白进行了跨膜区、高级结构及氨基酸序列比对等一系列生物信息学分析。应用qRT-PCR检测DsFAD2基因在氮(N)胁迫培养条件下的表达模式。[结果]DsFAD2蛋白定位于内质网中,有5个跨膜区,具有典型膜结合蛋白的结构特征。此外,DsFAD2也具有所有FAD2蛋白家族所特有的3个组氨酸保守区和芳香族氨基酸序列。系统发育分析发现杜氏盐藻DsFAD2与莱茵衣藻CrFAD2、团藻VcFAD2亲缘关系最近。qRT-PCR表明,与正常培养的杜氏盐藻相比,缺N培养显著诱导DsFAD2上调表达,N胁迫8d时DsFAD2的表达量是未胁迫对照的2.8倍。[结论]DsFAD2参与杜氏盐藻N胁迫响应,促进多不饱和脂肪酸形成,增强藻细胞抗逆性。本研究为进一步解析N胁迫条件下藻细胞油脂富集及响应分子机制提供了科学参考。     

猫爪草酰基-Δ9脱氢酶基因植物表达载体的构建及瞬时表达

猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7 FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检测来自猫爪草的酰基-ACP-Δ9脱氢酶(MucACP-Δ9D)是否可异源表达用于在其他植物合成ω-7 FA,文章构建了MucACP-Δ9D基因植物表达载体,并通过农杆菌介导在本氏烟草叶组织瞬时表达。用气相色谱(GC)检测烟叶脂肪酸成分,结果显示,野生型及空载体对照的ω-7FA总含量仅为0.4%;然而,MucACP-Δ9D瞬时表达的烟叶组织ω-7 FA总含量提高到14.2%,其中,C16∶1Δ9和C18∶1Δ11含量分别达8.8%和5.4%。研究表明,MucACP-Δ9D可在异源组织催化棕榈油酸合成,可进一步用于其他油料作物的油脂遗传改良,以富集ω-7 FA。     

MxIrt1基因瞬时表达载体的构建及其定位的初步研究

以绿色荧光蛋白为标记,构建瞬时表达载体pMxIRT1-GFP。以基因枪轰击洋葱表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜(Confocal)观察,MxIrt1基因主要定位在细胞膜上。     

八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

AtDME1化学诱导表达载体的构建及其瞬时表达

以拟南芥去甲基化转移酶基因DME1为目的基因,采用酶切、连接和重组反应的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体p ER8-DME1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中,通过烟草瞬时表达技术,对该载体的诱导表达特性进行了研究。q PCR结果表明,较低浓度的17-β-雌二醇处理能够有效调控p ER8-DME1中目的基因的表达,诱导处理后目的基因表达量逐渐升高,在12 h后达到最高,之后缓慢下降。该载体的成功构建为深入研究DNA去甲基化与植物的生殖发育调控奠定了基础。     

在烟草中瞬时表达迷迭香酸的研究

遗传转化一直以来都是研究药用植物次生代谢物调控的重要手段,虽然具有重现性好的优势,但获得稳定转化的毛状根体系或转基因植株往往费时费力,该方法无法满足大批量药用植物次生代谢调控相关基因的研究需求。农杆菌介导的瞬时转化以其易操作、低成本、短周期的优势,已被广泛应用于植物功能基因的研究中。然而目前药用植物的功能基因研究还常使用稳定遗传转化,或一些高成本、高难度的瞬时转化方法(如基因枪、原生质体转化等)。因此,本研究利用pEAQ载体在本氏烟草叶片中高效表达了一个或多个外源基因,这将为外源基因在烟草中快速有效的表达提供新途径,也为进一步探究其功能提供了一条思路。多个外源基因的高效共表达也为在本氏烟草中异源构建次生代谢途径提供了可能。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5’-Genome Walking和3’-RACE的方法,获得基因的5’-端DNA序列和3’-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5’-端DNA和3’-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1754bp,包括1137bp的开放读码框和617bp的3’-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

烟草NtNAC-R1基因内含子鉴定与瞬时表达分析

克隆烟草NtNAC-R1基因,并进行瞬时表达分析,探讨其是否含有内含子及其在烟碱生物合成中的调控作用.以烟草基因组DNA为模板克隆得到NAC转录因子NtNAC-R1,鉴定结果表明,该基因含有2个内含子.通过构建真核表达载体,建立瞬时表达分析体系,RT-PCR检测结果显示NtNAC-R1基因过表达,烟碱生物合成关键基因PMT表达量升高,JA信号途径标记基因PDF1.2和IAA响应基因IAA13表达量降低.瞬时表达分析表明,该基因受JA信号和IAA信号途径的交互对话影响,进而调控烟碱的生物合成.     

烟草WRKY-R1基因的克隆及瞬时表达分析

以烟草根尖组织cDNA为模板,RT-PCR结合电子克隆得到NtWRKY-R1基因的完整ORF,序列分析显示,NtWRKY-R1具有WRKY转录因子家族典型的WRKYGQK保守结构域及C2H2的锌指结构,属于WRKY转录因子家族第Ⅱ类。采用生物信息学方法对NtWRKY-R1蛋白的理化性质、进化关系和磷酸化位点进行预测和分析,结果表明,NtWRKY-R1与茄科植物保守结构域的同源性及系统进化关系最近;磷酸化位点分析显示该蛋白可能通过磷酸化作用修饰,进而对其相应的代谢活动进行调节。通过构建真核表达载体、建立瞬时表达分析体系,结果显示,NtWRKY-R1基因的过表达导致JA信号途径标记基因PDF1.2及烟碱合成关键酶基因PMT1表达量降低,推测NtWRKY-R1基因影响JA信号途径,进而调控烟碱合成。