家蚕G蛋白诅亚基（BmGγ1）的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子，参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制，运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基（Gγ1）的序列，设计引物验证预测序列后，克隆了家蚕Gγ1的序列，再通过酶切克隆至表达载体pET-41b（＋）后，导入E．coli BL21宿主菌中，经异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶（glutathione s-transferase，GST）融合蛋白，并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白，说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因，并在E．coli BL21中高效表达。     

家蚕G蛋白γ亚基BmGγ30A的克隆及其原核表达

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究G蛋白在家蚕中的生理功能及其作用机理,运用生物信息学方法预测到家蚕Gγ的一段序列,通过设计特异性引物、PCR和RACE技术,克隆得到家蚕Gγ30A的序列。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+),并导入E.coli BI21宿主菌中进行诱导表达。家蚕Gγ30A重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子量约38 KDa处,出现特异性蛋白条带,表达方式分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达;试验结果说明我们已成功克隆到家蚕Gγ30A基因(GeneBank登录号:HQ699664),并在E.coli BL21中高效表达。     

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的克隆及序列分析与融合表达

异三聚体G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到细胞内的重要分子,参与生物体内广泛的信号转导途径。采用生物信息学方法和RT-PCR、RACE技术克隆了家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的全长cDNA序列,该序列全长1374 bp,开放阅读框(ORF)1 128 bp,编码375个氨基酸。将构建的表达载体pET-41b(+)-Gα12转化E.coli BL21宿主菌进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测显示,BmGα12可在E.coli BL21中高效表达,GST-BmGα12融合蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约71 kD。系统进化分析显示BmGα12与大鼠和人Gα12/Gα13的亲缘关系较近,初步推测BmGα12介导的信号传导同样在细胞生长、胚胎发育中起重要作用。     

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα73B原核表达及其表达条件优化

通过RT-PCR技术从家蚕中扩增出G蛋白α亚基基因BmGα73B的cDNA,克隆至原核表达载体pET-41b(+)中,所获得的重组质粒经酶切鉴定后,将其转化至E coli BL21诱导表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 158 bp的蛋白基因,诱导表达重组质粒pET-41b(+)-Gα73B,经SDS-PAGE检测,IPTGr的终浓度为1 mmol/L时,诱导4 h时蛋白表达量最高,出现分子质量约为73 kD的目的蛋白带,与蛋白的理论值相符。经Western blot检测,表达产物可与GST发生特异性反应。     

家蚕γ-谷氨酰环化转移酶的纯化及其性质的研究

首次从家蚕(Bombyx mori L.)蛹体脂肪织织及真皮细胞分离得到催化丫-L-谷氨酰-2-L-氨基丁酸反应生成吡咯烷酮羧酸和2-L-氨基丁酸的Y-谷氨酰环化转移酶。并采用硫酸铵沉淀、葡聚糖G-75柱层析、DEAE-纤维素DE_(32)柱层析和羟基磷灰石柱层析等步骤,将该酶提纯了1,285倍。高度纯化后的酶,对Y-L-谷氨酰-2-L-氨基丁酸具有最适pH7.2-7.4,最适酶反应温度为47℃,米氏常数(Km)为0.04M。在分离纯化过程中未发现蚕体内有该酶的同功酶存在,纯化后的酶溶解于pH8.0、0.01M的Tris—HCl缓冲掖中,-30℃经过一个月没有发现明显的失活现象,但在4℃中一个月后丧失活性76％。     

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)的诱导表达定量分析

谷胱甘肽-S-转移酶(GST)在机体的解毒代谢和抗氧化中起重要作用。为探究家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因(BmGSTd1)在家蚕体内的解毒和抗性功能,采用实时荧光定量PCR方法,对BmGSTd1基因在正常饲养及添食NaF家蚕5龄幼虫不同组织中的转录水平进行检测,并采用家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA 3种内参照基因对检测结果进行归一化处理。BmGSTd1基因在家蚕5龄幼虫各组织的转录水平存在差异,且采用不同内参照基因结果不一致:分别以家蚕Actin3、GAPDH、28S rRNA基因为内参照,该基因转录水平最高的组织分别为中肠、丝腺、脂肪体。5龄第2天幼虫添食NaF对体内各组织中BmGSTd1基因的转录水平具有诱导作用,且在不同组织中诱导表达的情况不同,采用以上3种内参照基因进行归一化处理的结果数据表明,中肠和脂肪体组织中的诱导转录水平最高,可能与这2种组织是家蚕主要的解毒器官有关。研究认为,检测基因在不同组织中的转录水平,采用合适的内参照基因对保证检测结果的可靠性非常重要。     

家蚕和蓖麻蚕的γ-谷氨酰环化转移酶的组织分布及其活性动态

γ-谷氨酰环化转移酶(Y-GCT)催化γ-L-谷氨酰-L-氨基酸转换成5-氧-L-脯氨酸和L-氨基酸。当用γ-L-〔~(14)C〕-谷氨酰-α-L-氨基丁酸为该酶的底物时,观察到γ-GCT广泛分布于家蚕和蓖麻蚕的中肠、马氏管,后丝腙,脂肪体和体壁等组织中。家蚕各组织的γ-GCT在五龄中期均出现活力峰;并在白蛹期,脂肪体和体壁的γ-GCT突出地再现活力峰。这些结果表明,蚕体的γ-GCT的组织分布和活力变化,蚕体的γ-谷氨酰转肽酶和5-氧-L-脯氨酸酶存在相应关系,蚕体各主要组织细胞,将能通过这三种酶的联合作用吸收和传递氨基酸。     

家蚕谷胱甘肽硫-转移酶的组织分布及发育期变化规律

为明确家蚕谷胱甘肽硫-转移酶(GSTs)的生物学信息,对家蚕不同发育阶段GSTs的变化规律、5龄幼虫主要组织及不同品种间的GSTs活性差异进行了研究。家蚕GSTs在中肠、脂肪体、血淋巴、表皮、头部等组织中都有分布,脂肪体中GSTs活性最高,其次是中肠,头部最低。各发育阶段中,在由一种虫态变为另一种虫态的初始期GSTs活性较高,以后逐渐降低。在幼虫主要组织中GSTs活性5龄第3天最高,以后逐渐下降,至吐丝前达到较低的水平。抗性较强的夏秋蚕品种的GSTs活性高于春用蚕品种,杂交种的GSTs活性高于原种。研究结果提示家蚕GSTs活性与其组织器官的生理功能、品种抵抗性等相关联。     

家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析

周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。     

家蚕Bmsps1基因的克隆和原核表达

从家蚕EST数据中检索到果蝇(D.melanogaster)硒磷酸合成酶基因(patuf)的氨基酸序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕sps1的cds,用PCR克隆家蚕sps1基因序列.家蚕sps1基因cDNA长1817bp(登录号:ABA43639.1).利用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为94%,与大肠杆菌序列同源性最差为46%.Bmsps1基因在家蚕基因组中是单拷贝的,只有一个外显子.推导3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).同时我们对Bm sps1进行了原核表达研究.     

家蚕脂围蛋白(PLIN)基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳(N)蛋白基因的克隆与表达

以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物，通过RT－PCR技术，扩增其核衣壳（N）蛋白基因的cDNA；将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点；将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株，在浓度为1.0mM IPTG和37℃条件下诱导，PHN基因融合蛋白获得了表达；经SDS－PAGE，Western-blot试验，确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的47kD。试验结果证明，在大肠杆菌中表达的TGEV N基因的融合蛋白产物的确具有天然蛋白的抗原性。     

具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因的克隆及序列结构与表达研究

丙酮酸脱氢酶(PDH)是丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中的前件酶,参与生成柠檬酸循环(TCA)的起始物乙酰辅酶A,决定生物体内营养成分的分配。利用电子克隆、RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了与果蝇lethal(1)G0334基因类似的具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因。Bm-l(1)基因的cDNA全长为1 630 bp,由1 200 bp的完整ORF序列、186 bp的5'-UTR和207 bp的3'-UTR组成,含8个外显子和7个内含子,编码蛋白为399个氨基酸残基,分子质量43.93kD,pI 8.07。Bm-l(1)基因编码蛋白的69-365氨基酸残基为E1-dh结构域,该结构域为硫胺素焦磷酸依赖性脱氢酶所特有。蛋白质二级结构预测结果表明α螺旋占28.8%,β折叠占12.0%。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(1)基因编码蛋白与赤拟谷盗等昆虫的PDH具有63%以上的序列相似性,且保守区域高度一致。Bm-l(1)基因mRNA在家蚕整个卵期、幼虫期、蛹期和刚羽化的成虫中,以及5龄3 d幼虫的头部、丝腺、生殖腺、脂肪体、中肠和血液6种组织中都有较高的转录水平,且存在较小的组织差异性。     

人体醛缩酶C cDNA的克隆及其在家蚕体内的表达(英文)

利用人体醛缩酶C cNDA的一对特异性引物A ld-5′(5′-ggatcccctcactcgtaccca-3′)和A ld-3′(5′g-gatcctcag-taggcatggtt-3′),从人脑cDNA文库中PCR扩增出人体醛缩酶C cDNA,并依次被克隆进克隆载体pCR2.1、转移载体pAcGP67B以及来源于AcNPV和BmNPV的杂交重组病毒HyNPV。通过对家蚕血液的SDS-PAGE电泳和酶活力测定,证明人体醛缩酶C cDNA在家蚕体内成功得到表达。     

家蚕BmAWD基因的表达和蛋白纯化

家蚕BmAWD与家蚕翅膀发育密切相关,控制其翅膀发育的完整性及可用性。在对本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到-条编码AWD蛋白的cDNA序列,将其命名为BmAWD基因。通过生物信息学分析,发现该基因序列全长为689bp,ORF框为465bD,编码154个氨基酸残基,含有-个NDPK保守结构域。通过PCR扩增获得该基因ORF框并克隆到表达载体pGEX-5X-1上,得到重组表达质粒pGEX-5X-1-AWD,将该重组子转化大肠杆菌BL21,经PCR、酶切鉴定证明重组正确,在37℃下以IPTG诱导表达后收集菌体并裂解,SDS-PAGE分析发现在43kD左右处有一特异性蛋白条带,与预期值相符,但目的蛋白主要以沉淀即包涵体形式存在,25℃下诱导表达,SDS—PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-AWD,目的蛋白通过与层析柱上的GST磁珠结合而被纯化分离。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

紫花苜蓿γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的克隆与逆境下的表达分析

紫花苜蓿是目前全国乃至世界上种植最多的牧草,在畜牧业生产中发挥着重要的作用。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E合成途径中一种重要的合成酶,催化γ-生育酚向α-生育酚的转化,改变维生素E组成,利于动物和人体的吸收。本实验通过RACE-PCR技术,得到紫花苜蓿γ-TMT基因的全长cDNA序列,命名为MsTMT。测序和生物信息学分析表明,此序列全长1 306 bp,包含1个长为939 bp的完整开放阅读框(ORF),编码312个氨基酸。MsTMT属于甲基转移酶家族(AdoMet-MTases),有1个腺苷脱氨基酶信号(SLSTDDP),包含有2个保守的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(XXDXGCGIG,VXXPGGXXIX)。Real-time PCR检测结果表明MsTMT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中表达量最高。受NaCl、PEG以及黑暗诱导后,该基因表达上调;低温胁迫后该基因表达下降;外源ABA不影响该基因的表达。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT-PCR技术。用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株（China/99-2)中扩增得到一级750bp的DNA片段，克隆后，经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较。显示其与国外同源参考序列（O1K/66）的同源性为80.44%。与国内同型参考株（HB/WH/99）的核苷酸序列的同源性达99.06%。随后以重组质粒pGEM-VP1为模板，用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1(650bp)。对目的基因和表达载体pGEX-4T-1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体。转化宿 主菌BL21（DE3）后得到重组质粒pGEX-VP1。经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆。测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳，Western-blotting分析检测。结果表明，结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达，表达产物的分子量约为53ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经薄层扫描分析，表达蛋白约占菌体蛋白总量的20.00%。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达，且表达产物有一定的生物学活性。