玉米丝黑穗病菌的PCR检测

A pair of species-specific primer for sporisorium reilianum was designed according to the pra3 gene of sporisorium reilianum,and the results of polymerase chain reaction showed that a 499bp DNA was amplified by using the primers,and the PCR-based assay could detect more than 1pg fungal DNA using the primer.The PCR as a highly sensitive and reliable tool,could be used in detection of sporisorium reilianum.     

苗期PCR检测玉米丝黑穗病的取样时期及部位研究

以2份抗病及2份感病玉米自交系为试验材料,模拟玉米丝黑穗病适宜的侵染及田间发病条件,采用室内菌土接种方法培养玉米幼苗,通过PCR检测病原菌侵染率,研究苗期PCR检测抗、感玉米自交系的最佳取样时期和检测部位.结果表明,SSR标记SR3可用于玉米丝黑穗病室内接种鉴定;同一自交系不同的取样时期叶鞘侵染率均显著高于叶片侵染率;感病自交系与抗病自交系三叶期第3叶叶鞘的PCR侵染率差值极显著高于其他取样时期和取样部位,且该期4份自交系的侵染率与田间接种条件下的发病率呈显著正相关,为鉴别抗感自交系最佳的取样时期和部位.     

玉米丝黑穗病菌致病性分化研究

从我国玉米品种资源中筛选出6个具有广泛血缘代表性的自交系B73、掖478、Mo17、齐319、黄早四和丹340作为玉米丝黑穗病菌的生理分化鉴别寄主,确定了玉米丝黑穗病菌生理分化鉴别寄主体系。利用6个抗病性差异明显的鉴别寄主对玉米丝黑穗病菌进行生理分化鉴定,结果鉴别出7个生理分化致病类型。     

玉米丝黑穗病菌DNA多态性的初步研究

从169个随机引物中筛选出了9个单引物和3个双引物,利用这些引物对玉米丝黑穗病菌进行了RAPD遗传多态性分析。聚类分析结果将24个菌株划分为3个致病类型:菌株03-12、03-13、03-01、03-02、03-03、03-11、03-04、03-16、03-07、03-08和03-14聚为一类;03-18、03-20、03-17、03-26、03-29、03-27、03-23、03-25、03-28聚为一类;03-21、03-22、03-15和03-10聚为一类。表明玉米丝黑穗病菌菌株间存在一定的遗传多态性和遗传分化,分化与菌株地域来源关系不大。     

玉米对丝黑穗病菌抗性影响因子研究

在进行抗病性鉴定的基础上,测定了抗、感病品种胚芽和胚根内的N、P、K、可溶性糖和维生素C的含量以及不同时期玉米生长点内防御酶活性的变化。结果表明：玉米对丝黑穗病菌的抗性与胚根和胚芽内的N、P、K含量呈正相关,与Vc和可溶性糖含量呈负相关。当病菌侵入后抗病品种苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性上升幅度高于感病品种,而多酚氧化酶(PPO)、酯酶(EST)和超氧化物歧化酶(SOD)在感病品种中上升幅度高。土壤施用氮肥和钾肥能明显提高玉米对丝黑穗病菌的抗性,磷肥效果不明显。     

6省区玉米丝黑穗病菌遗传多样性分析

采用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对我国6省区玉米丝黑穗病菌的生理分化情况进行了初步研究。通过10个随机引物将来自于吉林、辽宁、黑龙江、山西、河北、内蒙古自治区的102株玉米丝黑穗病菌大致划分为6个类群(相似系数0.42),在更高的相似水平上,类群A和类群B还可以进一步划分为众多的亚群。从聚类分析的结果可以看出,相似性较高的菌株大多来源于相同或相近的地区,说明玉米丝黑穗病菌的亲缘关系存在一定的地域性。     

玉米丝黑穗病菌对植株体内内源激素水平改变的影响

采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,测定玉米苗期接种丝黑穗病菌后植株体内生长素(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素核苷(ZR)和脱落酸(ABA)4种内源激素的含量变化,从寄主与病菌互作过程中植物内源激素的变化研究玉米对丝黑穗病的抗性机制。研究结果表明,玉米丝黑穗病菌侵染玉米植株后,植株体内单一激素ABA含量提高;IAA、GA和ZR的含量降低;IAA/ABA、ZR/ABA、GA/ABA及(IAA+GA+ZR)/ABA的比值均明显低于对照。激素间的比值变化较单一激素的含量变化更加显著,相对单一激素的调控作用,激素间相互作用对调节植株生长发育更为重要。玉米丝黑穗病菌侵染玉米的过程中,植物内源激素的一系列变化可能是引起植株出现畸形症状(如节间缩短、植株矮化和丛生等)的直接原因。     

玉米丝黑穗病菌致病力分化研究

采用土壤接种方法,对采自黑龙江省不同玉米生产区的3个菌株进行了致病力分化测定。试验结果表明,来自不同地区的菌株对同一玉米自交系(品种)的致病力无明显差异。哈尔滨、佳木斯和肇东的3个菌株对Mo17和维27的发病率为0～5%,哈尔滨的菌株对龙抗11的发病率为9.4%。相对比较而言,佳木斯和肇东地区的菌株致病力稍低。     

玉米丝黑穗病菌DNA提取及UP-PCR反应体系建立

采用CTAB法、SDS法和尿素法,从玉米丝黑穗病菌液体培养物中提取基因组DNA,比较其提取效果。结果表明：改进的CTAB法可有效去除多酚、多糖和色素等杂质对DNA的污染,可获得高质量模板DNA。以此为模板进行UP-PCR(Universally Primed PCR)反应,对UP-PCR扩增反应中的一些重要参数进行了优化,建立适合于玉米丝黑穗菌的UP-PCR反应体系。     

玉米丝黑穗病侵染率与发病率关系的PCR检测分析

用2个感病的玉米材料接种玉米丝黑穗病菌,苗期调查侵染率,开花期调查发病率,结果表明侵染率显著高于发病率;在开花期提取未发病植株茎髓组织DNA进行PCR检测,结果检测到玉米丝黑穗病菌DNA的存在。因此,通常情况下玉米丝黑穗病侵染率大于发病率。     

PCR对转基因玉米MON810的鉴定检测

本研究成功建立了商业化种植的转基因玉米MON810的筛选检测和品种鉴定的PCR方法.该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因扩增226 bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果;同时扩增CaMV35S启动子基因195 bp片段,可以对MON810转基因玉米进行筛选检测;此外,根据MON810品种设计的特异性鉴定检测引物,可扩增Maize genome/CaMV35S基因170 bp片段和HSP/CryIA(b)基因194bp片段,具有很强的品种特异性,达到了对MON810转基因玉米的品种鉴定目的.PCR反应循环参数是94℃2 min;94℃40sec,55℃60sec,72℃60sec,35次循环;之后72℃延伸5 min。     

小麦和玉米籽粒赤霉菌产毒类型的PCR检测

为了建立一种准确、快速鉴定赤霉菌毒素的方法,根据赤霉菌毒素生物合成调控路径T ri5-T ri6基因保守序列,设计了一对通用引物,用于检测和鉴别产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(N IV)毒素的赤霉菌特异DNA片断。结果表明,产生毒素DON的赤霉菌具有一个300 bp的特异DNA片断,而产生毒素N IV的则为360 bp。PCR检测与HPLC或GC/M S化学分析结果完全一致。利用这一方法分析检测了小麦、玉米籽粒中赤霉菌产毒类型,发现除健康籽粒外,在所有轻微、中度、严重感染赤霉病的小麦或玉米籽粒中,均同时检测到DON及N IV的两种DNA片断,表明这一对通用引物对两种毒素特异DNA片断的扩增效率相同。这些结果说明,该技术是一种经济、快速、可靠的PCR检测技术,可广泛用于赤霉菌及其毒素检测鉴定中。     

应用直接PCR技术快速筛查转基因玉米方法研究

以转CP4-epsps基因玉米为研究对象,用玉米内标准基因z SSIIb及3种常见转基因成分(Ca MV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基因)为检测靶标,建立基于直接PCR技术的玉米转基因成分筛查方法。此方法不用提取纯化DNA,只需取直径约为0.5 mm的叶片加到PCR反应体系中进行扩增,与常规PCR方法相比,在保证结果准确性的同时,大大缩短检测时间,提高工作效率。此方法具有操作简便、结果可靠等优点,适用于玉米叶片中转基因成分的快速筛查。     

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。     

茶毛虫感染核型多角体病毒(EpNPV)的快速分子鉴定

根据茶毛虫核型多角体病毒(Euproctis pseudoconspera nuclear polyhedrosis virus,EpNPV)两个核心基因A13-1lef-8和A13-1polyhedrin的核苷酸序列,设计合成了两对特异性引物,应用PCR方法分别扩增获得538bp和281bp的2个DNA片段。克隆至T载体测序后与Genbank中已知EpNPV两基因序列比对,匹配率为100%。证实所克隆的特异性DNA片段可以作为鉴定茶毛虫感染EpNPV的标志性序列。本研究建立了茶毛虫感染EpNPV的分子鉴定方法,并为EpNPV防治茶毛虫效果的评价以及EpNPV侵染茶毛虫途径等毒理学研究提供依据。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。     

转基因玉米MON87427/zSSIIb 二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准物质,实现对DNA分子的绝对定量,已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法,获得准确测量结果,本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料,探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品,将5个不同的玉米内标基因分别与MON87427组合,通过优化退火温度,根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值的一致性等,确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb,最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测,二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性,表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。     

58份鲜食玉米品种对瘤黑粉病和丝黑穗病的抗性评价

2020-2022年通过田间人工接种,对58份鲜食玉米品种进行抗性鉴定和评价,明确玉米品种对瘤黑粉病和丝黑穗病的抗性差异。结果表明,58份鲜食玉米中未检测出高抗(HR)瘤黑粉病品种,1份品种原玉糯999表现抗病(R),占比1.7%;福甜73、白甜糯3号、白玉糯2020、甘糯2020等4份材料表现中抗(MR),占比6.9%;27份品种表现感病(S),占比46.6%;26份品种表现高感(HS),占比44.8%。对丝黑穗病鉴定结果表明,未发现高抗(HR)和抗病(R)品种,仅1份品种永糯321表现中抗(MR);其余20份和37份材料分别表现感病(S)和高感(HS),分别占鉴定材料的34.5%和63.8%。