团头鲂Dmrt4基因的克隆与表达分析

为研究团头鲂Dmrt4基因的可能作用,采用RACE-PCR技术克隆了团头鲂卵巢Dmrt4基因的cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术对其胚胎及出膜后30 d内各期、成鱼不同组织、雌雄性腺各分期的表达进行研究。结果表明,团头鲂Dmrt4基因至少存在2种不同的剪接形式,分别命名为Dmrt4a 和Dmrt4b。其中,Dmrt4a cDNA全长1 265 bp,编码352个氨基酸,含DM和DMA 2个结构域;Dmrt4b cDNA全长1 081 bp,编码281个氨基酸,仅含DMA结构域。氨基酸序列同源性分析显示,团头鲂Dmrt4与牙鲆、奥利亚罗非鱼的同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明,Dmrt4基因在团头鲂胚胎期至出膜后30 d内均有表达,且在受精后32 h的表达量最高;成鱼卵巢的表达量显著高于其他组织（P<0.01）;Ⅱ期卵巢的表达量显著高于其他时期,也显著高于精巢各分期（P<0.01）。上述结果表明,Dmrt4基因可能对团头鲂卵母细胞初期的生长起到重要作用,在雌鱼性腺发育过程中亦发挥一定的作用。     

斑节对虾钙网蛋白基因cDNA克隆和表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNAends,RACE)获得了1 672 bp的斑节对虾钙网蛋白(Penaeusmonodon calreticulin,PmCRT)基因cDNA序列。该序列包含37 bp的5’非编码区(UTR)和414 bp的3’非编码区(UTR)以及1 221 bp的开放阅读框(ORF),可编码406个氨基酸。预测的分子量约为46.8ku,理论等电点为4.13。序列比对分析表明PmCRT与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的相似性和同源性最高,分别为100%和98.8%。实时荧光定量PCR对组织表达检测的结果可知,PmCRT的mRNA在卵巢、肝胰腺、肌肉、脑、心脏、胃、眼柄和肠均有表达,卵巢的表达量最高,肌肉次之;对卵巢发育6期变化检测可知,PmCRT的mRNA在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅰ期的表达量最低。以期为进一步研究该基因在斑节对虾卵巢发育中的作用提供基础数据。研究亮点:目前对斑节对虾卵巢发育的分子调控机理还知之甚少,有大量卵巢发育相关基因还不为人所知。本文研究了钙网蛋白在斑节对虾卵巢发育各期的表达谱,为阐明斑节对虾卵巢发育分子调控机理提供基础数据。     

斑节对虾腺苷酸转移酶(PmANT)基因的cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术获得了斑节对虾(Penaeus monodon)ANT基因(PmANT)的cDNA序列。该序列全长1 388 bp,开放阅读框(ORF)为930 bp,3’非编码区(UTR)为393 bp,5’非编码区(UTR)为65 bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量大约为33.622 ku。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了ANT基因在雌雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在各组织中都有表达,其中,在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。     

福瑞鲤β-catenin2基因的克隆与表达分析

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子,参与调控性腺发育和分化。本研究首次克隆得到福瑞鲤(Cyprinus carpio)β-catenin2的c DNA全长序列,采用荧光定量PCR技术分析了β-catenin2基因的组织表达模式及注射外源性激素对福瑞鲤β-catenin2基因表达的影响。结果表明,β-catenin2 c DNA全长3 411 bp,编码780个氨基酸,预测分子量为85. 52 ku;实时荧光定量PCR表明,β-catenin2 mRNA在血液中表达量最高,其次是性腺和脾脏;且β-catenin2 mRNA表达量在福瑞鲤性腺发育早期,随着性腺发育的成熟而升高。睾丸甾酮(T)处理后发现:卵巢中β-catenin2 mRNA表达量在10μg/g 24 h处理组显著升高(P 0. 05),精巢中β-catenin2 mRNA表达量在10μg/g和50μg/g 24 h、48 h处理组显著降低(P 0. 05)。17β-雌二醇(E2)处理后发现:精巢和卵巢中β-catenin2 mRNA表达量无显著变化(P 0. 05);以上结果表明,β-catenin2在福瑞鲤性腺发育早期是必需的。     

尼罗罗非鱼Dmrt1基冈克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用.参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物,扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因,并对扩增产物进行了亚克隆与测序.结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段.长度为140bp.序列无性别差异.序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrt1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78%;编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89%,充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性.进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT-PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究.结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达.在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用.     

雌二醇刺激对菲律宾蛤仔Dmrt基因表达的影响

为研究菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum不同发育时期及雌二醇刺激下Dmrt基因组织表达的变化状况,在菲律宾蛤仔基因组数据中(未发表),运用BLASTe比对确定了菲律宾蛤仔的3个Dmrt基因,运用MEGA、expasy、SMART等软件进行基因结构和进化分析,根据系统发生树的聚类对3个Dmrt基因进行命名,分别为Dmrt3-like、Dmrt4-like-1、Dmrt4-like-2,并采用实时荧光定量PCR方法对Dmrt基因在菲律宾蛤仔中的时空表达及其对雌二醇处理的响应进行了研究。结果表明:菲律宾蛤仔Dmrt 3个基因的表达量从担轮幼虫到壳顶幼虫时期呈迅速增长趋势,其中Dmrt4-like-2在菲律宾蛤仔的不同发育时期均有表达;在未进行雌二醇激素处理的正常菲律宾蛤仔体内,Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2在鳃和外套膜中表达量最高,Dmrt3-like在鳃和内脏团中表达量较高,在外套膜和水管中不表达;短时期内(72 h)雌二醇浸泡处理使得这3个基因在菲律宾蛤仔性腺中的表达量均发生上调;长时期(60 d)雌二醇浸泡处理后,空白组的雄性性腺中3个基因的表达量皆高于雌性性腺,试验组雌雄同体性腺中的Dmrt4-like-1和Dmrt4-like-2表达量略高于雌性中的表达量(P0.05),但显著低于雄性中的表达量(P0.05)。研究表明,菲律宾蛤仔Dmrt基因家族参与性别分化、性腺发育过程。     

尼罗罗非鱼Dmrt1基因克隆及在不同组织中的表达

Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用。参照小鼠Dmrt1基因DM保守区及有关文献,设计了1对简并引物．扩增了尼罗罗非鱼的Dmrt1基因．并对扩增产物进行了亚克隆与测序。结果在雌雄尼罗罗非鱼个体中各获得1个预期的基因片段．长度为140bp．序列无性别差异。序列同源性分析表明,尼罗罗非鱼Dmrt1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性为78％：编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性为89％．充分显示了Dmrt1基因在进化上的高度保守性。进一步根据获得的Dmrt1序列,设计1对特异引物,采用RT—PCR技术对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1基因的表达进行了研究。结果发现,Dmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达,提示该基因在性别分化和功能维持上可能具有重要作用。     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

尼奥罗非鱼及其亲本中性别分化相关基因的表达模式比较

Dmrt1、Amh、Cyp19a1a、Foxl2是鱼类性别决定与分化相关的重要基因,为了研究罗非鱼种间杂交后代的性别形成机制,对尼奥罗非鱼Oreochromis niloticus(尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus♀×奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus♂)及其亲本中这4个性别分化相关基因的性别表达模式进行了比较分析。结果表明:Dmrt1、Amh基因在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼精巢中的表达量显著或极显著高于卵巢(P0.05或P0.01),而Cyp19a1a、Foxl2基因在卵巢中的表达量则显著高于精巢(P0.05),4个基因在尼奥罗非鱼精巢、卵巢中的表达模式与其亲本基本一致;奥利亚罗非鱼精巢中Dmrt1基因表达高于尼罗罗非鱼,卵巢中Cyp19a1a、Foxl2基因表达也高于尼罗罗非鱼;尼奥罗非鱼精巢、卵巢中4个基因的表达水平均低于其亲本,特别是精巢中Cyp19a1a、Foxl2基因的表达水平极低。推测Cyp19a1a表达抑制可能是引起尼奥罗非鱼雄性率高的重要条件之一。     

白斑狗鱼FOXL2基因克隆及其表达

为白斑狗鱼性别发育机制和功能分析研究提供基础资料,通过克隆FOXL2基因cDNA序列,对其进行相关生物信息学分析,并进行荧光定量PCR检测FOXL2基因在白斑狗鱼不同时期各组织的表达情况。结果表明：以白斑狗鱼卵巢cDNA为模板克隆得1483 bp的FOXL2基因序列,其编码292个氨基酸与鲑形目鱼类的FOXL2氨基酸序列同源性较高; FOXL2基因在白斑狗鱼性腺、鳃和脑中均有不同程度的表达,而在其他组织中基本无表达,卵巢表达量是精巢表达量的12倍,呈现出特别明显的性别二态性。推测FOXL2基因可能与白斑狗鱼卵巢发育和功能维持相关。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析

为了解罗布麻査尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78%~81%,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

草鱼JAK2基因片段序列的克隆及其组织表达分析

通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法从草鱼肝脏中首次克隆获得草鱼JAK2基因的片段序列。该片段序列长671 bp,编码223个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼JAK2基因片段与其他物种的相似性在70%～91%之间;系统进化树显示,鱼类的JAK2独立聚成一支,草鱼与斑马鱼聚成一支,与鳜鱼和墨绿凹鼻鲀聚成的一支再聚成一支。实时荧光定量PCR分析表明,草鱼JAK2基因在肝脏、肌肉、脑、心脏、脾脏和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在肝脏组织中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),其次是肌肉、脑、脾脏和肠系膜脂肪组织,在心脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P<0.05)。本研究为进一步研究草鱼JAK2基因的结构和功能奠定了基础。研究亮点:JAK2基因在鱼类上的研究报道甚少。本研究首次克隆了草鱼JAK2基因片段序列;且发现JAK2基因在肝脏组织中表达量最高,心脏组织中表达量最低,为草鱼JAK2基因的结构及其信号转导等生理功能的深入研究奠定了基础。     

草鱼胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1基因的全长cDNA克隆及表达

克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus）胰岛素样生长因子结合蛋白 1(IGFBP-1)基因的全长cDNA,并对草鱼不同时期的胚胎和成鱼不同组织进行了RT-PCR分析,以探索草鱼IGFBP-1基因的生物学功能。结果显示：(1)草鱼IGFBP-1基因cDNA全长为1 135 bp,包含一个789 bp阅读框,编码262个氨基酸残基;草鱼与鲤、斑马鱼、沟鲶、大鳞大麻哈鱼、虹鳟、五条、小鼠和人的IGFBP-1氨基酸序列相似度分别为94%、93%、69%、60%、58%、56%、40%和38%;草鱼IGFBP-1蛋白的N端和C端序列负责与胰岛素样生长因子(IGF)结合,其保守性较高。(2)RT-PCR分析结果表明,草鱼胚胎期IGFBP-1 mRNA的表达水平很低,在受精后4 hrs和8 hrs胚胎未能检测到转录本,受精12 hrs后,仅能检测到微量表达;草鱼IGFBP-1mRNA在肝脏、肾脏、肠和心脏组织中具有表达活性。鉴于IGFBP-1基因在IGF信号通路中的重要作用,又是一个低氧诱导基因,上述结果可为进一步探索IGFBP-1基因的功能奠定基础。     

尼罗罗非鱼性别相关基因Dmrt1的RACE扩增和序列分析

[目的]为研究Dmrt基因的进化、尼罗罗非鱼性别决定机制和功能提供资料。[方法]以尼罗罗非鱼精巢cDNA为模板,采用简并PCR扩增和克隆其Dmrt保守区域,并采用3′RACE反应获得Dmrt1基因全序列。[结果]尼罗罗非鱼中Dmrt保守区域长度为158 bp。尼罗罗非鱼Dmrt1基因的DM-domain与奥利亚罗非鱼、虹鳟、青鱼将、新月鱼、人、小鼠中Dmrt1基因的DM-domain和尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼中DMO基因的DM-domain的核苷酸同源性分别为98.6%、87.9%、81.4%、82.1%、77.9%、77.1%、72.1%、72.1%,氨基酸同源性为100.0%9、7.8%、87.0%、87.0%、89.1%、89.1%、84.8%和84.8%。通过3′RACE反应,获得1 108 bpDmrt1的3′端序列。尼罗罗非鱼Dmrt1与奥利亚罗非鱼、虹鳟、青鱼将、新月鱼的氨基酸序列同源性分别为99.0%、62.0%、41.0%和73.0%。[结论]Dmrt1基因具有高度保守性。     

家兔Dmrt1全长cDNA的克隆和组织表达

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和RACE的方法克隆了家兔Dmrt1全长cDNA基因.氨基酸序列分析表明,家兔Dmrt1与其他哺乳类Dmrt1基因的氨基酸序列同源性较高,而与鱼类、两栖类、鸟类等氨基酸序列的同源性较低.RT-PCR分析表明,Dmrt1基因只在家兔的精巢和卵巢中表达,而在脑、垂体、肺、心脏、肝脏、肠、脾脏、肾、肌肉等组织中均不表达,且精巢中的表达量高于卵巢.这一结果表明,Dmrt1可能参与了家兔的性别决定过程.