策勒黑羊GDF9和BMP15基因多态性与产羔数关联分析

为了鉴定策勒黑羊BMP15和GDF9中的多态位点,并与产羔数性状进行关联分析,对相同饲养条件下81只具有产羔记录的策勒黑羊BMP15和GDF9基因完整ORF区进行测序。结果显示,在两个重要候选基因中共存在16个多态位点。GDF9基因有7个SNPs（分别为g.41769976G＞A、g.41769833G＞A、g.41769898G＞A、g.41769246A＞G、g.41769008T＞C、g.41769002A＞G）和g.41769723 TCAA缺失,其中：g.41769833G＞A 位点AA型比GG型平均多0.22只（P＜0.05）,其余6个突变位点均与产羔数不存在显著相关（P＞0.05）。BMP15基因存在9个突变位点：g.50986052C＞A、g.50985229A＞G、g.50985162T＞C、g.50985071C＞T、g.50983056C＞G、g.50982538T＞C、g.50981129A＞G、g.50980656T＞C和g.50981170T＞A,且这9个SNP位点与产羔数均不存在显著相关（P＞0.05）。结果可为策勒黑羊种群的保种育种提供理论参考。     

BMP15基因在不同品种鸡卵泡中的表达规律

以淮南麻黄鸡和邵伯鸡为试验素材,研究骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因在2个群体卵泡颗粒层和膜层中的表达模式及差异。结果表明,在颗粒层中,BMP15在2个群体的卵泡不同发育时期表达模式均呈先增加后降低的趋势,发育到小黄卵泡(small yellow follicle,SFY)时期呈现表达高峰,显著高于其他各等级卵泡的表达量(P0.05,P0.01),之后表达量显著下降;不同时期同一等级卵泡颗粒层中的表达均表现为24周高于43周,小黄卵泡时期表现为24周显著高于43周(P0.05)。在膜层中,BMP15在2个品种的卵泡不同发育时期表达模式均呈"低→高→低"的趋势,表达高峰出现在小黄卵泡(SYF)时期,显著高于其他各等级卵泡的表达量(P0.05)。不同时期同一等级卵泡膜层中的表达基本相似,均表现为24周表达量高于43周,在小黄卵泡(SYF)时期膜层表达量表现为24周显著高于43周(P0.05)。BMP15基因的表达量在各级卵泡的颗粒层和膜层在2个群体间差异不显著。综合BMP15在2个群体不同时期卵泡的颗粒层和膜层中的表达模式研究表明,BMP15在鸡的卵泡发育过程中的表达存在时间、品种和组织差异性。     

卵形鲳鲹 SST1基因的克隆与组织表达

为了解卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus） SST1基因的生物学信息、胚胎发育不同时期的表达水平及其在组织中的表达和分布情况,进而探讨 SST1基因可能的生理功能及作用机制。对卵形鲳鯵基因组（登录号: PRJNA574895）中的 SST1基因（ID:EVM0001630）进行生物信息学分析,并对其在卵形鲳鯵胚胎发育的不同时期及其在幼鱼不同组织中的表达情况进行定量分析。结果表明,卵形鲳鲹的 SST1基因全长1 155 bp,开放阅读框序列长1 104 bp,共编码368个氨基酸,蛋白分子质量为41.42 ku,理论等电点pI为8.47,属于带正电的疏水性蛋白。SST1蛋白无信号肽序列,亚细胞定位主要于细胞质膜,属于膜蛋白,包含17个磷酸化位点,存在7个跨膜结构域,三维结构主体为7段α-螺旋并列扭曲排列成的一柱状结构。序列比对和系统进化树分析显示,卵形鲳鲹与黄尾鰤和高体鰤共聚于一个分支,氨基酸序列同一性分别为98.39%和  98.37%。定量PCR分析结果表明, SST1在卵形鲳鲹胚胎发育的前13个时期微量表达,进入初孵仔期表达量迅速升高。 SST1在卵形鲳鲹幼鱼不同组织中的表达量差异极显著,其中在脑组织中表达量最高,其次是卵巢和精巢,在背鳍、皮肤、肌肉等其他11个组织中的表达量相对较低。说明 SST1在卵形鲳鲹神经内分泌、性腺发育及生殖细胞发生过程中可能发挥着重要作用。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

小麦TaSPL17基因的克隆、组织特异性表达及原核表达分析

具有SBP结构域的SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用。为了进一步研究小麦基因TaSPL17的功能,本研究通过同源克隆的方法,从普通小麦品种‘小偃22’中克隆得到TaSPL17基因全长CDS序列。生物信息学分析表明,该基因开放阅读框长度1 158bp,编码385个氨基酸,理论分子质量40.25ku,理论等电点为9.12。半定量RT-PCR结果显示,TaSPL17在小麦根、茎基部、叶片、幼穗中均有表达,在幼穗和茎基部中表达量最高,根次之,在叶片中表达量最少,表明TaSPL17基因可能与小麦的分蘖和穗部的发育有关。将基因TaSPL17与载体pGEX6P-1连接构建原核重组表达载体pGEX6P-1-TaSPL17,然后将其转入大肠杆菌DH5α并对诱导表达的时间、IPTG浓度、温度进行优化,SDS-PAGE分析表明,融合GST标签的TaSPL17在温度37℃,IPTG浓度为0.4mmol/L,诱导3h后表达量最大,有助于进一步纯化TaSPL17蛋白质。     

矮牵牛PhSPL9b基因的克隆及功能分析

为研究SPL（SQUAMOSA-promoter binding protein-like）转录因子在矮牵牛成花转换中的作用,克隆矮牵牛PhSPL9b基因,并将该基因对应的miR156/157靶位点进行点突变获得rPhSPL9b,将PhSPL9b和rPhSPL9b分别构建超量表达载体,转化矮牵牛和拟南芥,最终获得拟南芥35S∶∶PhSPL9b与35S∶∶rPhSPL9b转基因植株以及矮牵牛35S∶∶PhSPL9b转基因植株。研究结果显示,过表达PhSPL9b和rPhSPL9b导致拟南芥莲座叶显著减少,花期明显提前,其中35S∶∶rPhSPL9b转基因表型更为明显;过表达PhSPL9b促进矮牵牛提前开花。RT-PCR和qRT-PCR分析结果显示,表型明显的转基因株系中,PhSPL9b基因表达量均显著高于对照。转录激活实验结果表明,PhSPL9b是一个具有转录激活活性的转录因子。以上结果表明,矮牵牛PhSPL9b基因对开花时间具有重要调控作用,其功能具有保守性,同时,它可能是通过转录激活下游基因的表达而影响植物开花。     

白菜型油菜‘陇油6号’ COR15-like基因的克隆与表达

为探究COR基因在油菜抵御逆境胁迫中的作用,采用RACE技术从白菜型油菜‘陇油6号’克隆获得1个新的COR15-like基因BrCOR15,该基因全长616bp,其中,5′非翻译区59bp,3′非翻译区167bp,开放阅读框390bp,编码129个氨基酸,推测其蛋白分子质量为13.9ku,理论等电点为5.2。该基因编码蛋白质的氨基酸序列与多种植物具有较高一致性,与拟南芥AtCOR15、AtCOR15a,高山离子芥CbCOR15,高山葶苈DaCOR15a、DaCOR15b的氨基酸序列一致性分别为74.6%、77.7%、72.3%、77.9%和76.7%。实时荧光定量PCR分析表明,BrCOR15基因在油菜的茎、叶和下胚轴均有表达,无组织特异性;该基因表达受低温、ABA和H2O2诱导,与单独处理结果相比,经MAPKK抑制剂U0126预处理12h再经低温、ABA和H2O2处理后,BrCOR15基因的表达量明显降低,表明该基因在油菜适应低温、ABA和H2O2胁迫过程中发挥作用。     

东湖F1代BMPR-1B和BMP15基因多态性 与产羔性能关联性分析

为探究候选基因BMPR-1B、BMP15与东弗里生羊♂和湖羊♀的杂交F₁代（东湖F₁羊）产羔数间的关联性,评估东弗里生羊作为引入品种的经济利用价值,使用PCR-RFLP技术对东湖F₁羊和湖羊的BMPR-1B、BMP15基因多态性与产羔数进行关联分析。结果显示,东湖F₁羊与湖羊群体内均未检测出BMP15基因的FecX^I突变。BMPR-1B基因FecB突变位点在湖羊群体中检测出AG、GG两种基因型,基因频率分别为0.064和0.936,优势基因型为GG型,等位基因A、G的基因频率分别为0.032和0.968,优势基因为等位基因G;在东湖F₁羊群体中检测出AA、AG和GG 3种基因型,基因频率分别为0.146、0.683和0.171,优势基因型为AG型,等位基因A、G的基因频率分别为0.488和0.512。表明对产羔有利的G等位基因可以通过东弗里生和湖羊杂交遗传给后代,可作为其分子育种的辅助选择标记。湖羊AG型与GG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）,东湖F₁羊 GG型、AG型个体产羔数极显著高于AA型个体（0.01＜P＜0.05）,GG型与AG型个体产羔数差异不显著（P＞0.05）。结果表明东湖F₁羊产羔数与BMPR-1B基因显著相关。     

BMPR-IB、BMP15和GDF9基因作为滩羊繁殖性状主效候选基因的研究

以控制绵羊高繁殖力的BMPR-IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法分析滩羊BMPR-IB,BMP15和GDF9基因多态性与繁殖性状的关系.试验结果表明,滩羊的BMPR-IB基因出现了两个SNP位点,且在相应位置发生了与Booroola羊相同的突变(A746G),该基因++基因型在滩羊群体内是优势基因型,但是双胎母羊和其后代的BB和B+基因型频率均高于单胎母羊,双胎羔羊和单胎母羊++和B+基因型频率最小二乘均值差异显著(P<0.05),两个母羊群体各基因型之间平均产羔数差异不显著(P>0.05),从而推测含有BMPR-IB基因突变的滩羊具有产双羔的潜力,可以作为滩羊选种选育的一项指标.而BMP15基因的B4突变(G→T)和GDF9基因的G8突变(C→T)在滩羊上不表现多态性,因此排除了BMP15基因的B4突变和GDF9基因的G8突变是影响滩羊繁殖性能的可能性.     

安徽白山羊、波尔山羊GDF9和BMP15基因的RFLP分析

以绵羊高繁殖性能主效基因,生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)和骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法检测其在安徽白山羊、波尔山羊中的多态性。结果表明,均未能检测至GDF9基因的G8突变(C→T)及BMP15基因的B4突变(G→T)。这2个山羊群体中均为野生型,由此表明这2个候选基因检测位点在安徽白山羊、波尔山羊中没有多态性。     

内蒙古白绒山羊GHR和GDF9基因多态性及其与生产性状的相关性分析

【目的】探究生长激素受体(GHR)和生长分化因子9(GDF9)基因多态性与内蒙古白绒山羊生产性状的相关性。【方法】采集452只阿拉善品系内蒙古白绒山羊雌性个体(其中包括382只18月龄左右的育成羊和70只36月龄左右的成年羊)的耳组织并测定其体质量和体尺数据。提取试验羊耳组织的DNA,通过InDel分型和琼脂糖凝胶电泳技术鉴定出452只内蒙古白绒山羊GHR和GDF9基因的多态性,利用SPSS 23.0分析软件探讨其与生产性状的相关性。【结果】在内蒙古白绒山羊GHR基因第1内含子中检测到9-bp插入缺失标记(InDel)位点(NC_022312:g.42801_42809delCTGTGGCAT),该位点属于低度多态(PIC0.25)且处于哈代-温伯格平衡状态(P0.05);在GDF9基因3′调控区检测到12-bp InDel位点(NC_022299.1:g.66028950insTACTTTCAACAA),该位点属于中度多态(0.25PIC0.50)且处于哈代-温伯格非平衡状态(P0.05),2个InDel位点均存在纯合插入型、杂合型和纯合缺失型3种基因型。在育成羊中,GHR基因第1内含子中9-bp InDel位点纯合插入基因型个体体质量、体长、胸围和胸宽均值显著大于杂合基因型个体(P0.05);在成年羊中该位点两种基因型间各生长指标差异不显著(P0.05)。在育成羊中,GDF9基因3′调控区12-bp InDel位点杂合基因型和纯合缺失基因型个体体质量、体高和胸围均值极显著大于纯合插入基因型(P0.01);在成年羊中,GDF9基因该InDel位点纯合插入基因型个体体质量、胸围和管围均值显著大于纯合缺失基因型(P0.05)。【结论】GDF9基因3′调控区12-bp InDel位点和GHR基因第1内含子中9-bp InDel位点多态性与内蒙古白绒山羊体质量和部分生长性状具有显著或极显著的相关性。     

草鱼JAK2基因片段序列的克隆及其组织表达分析

通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法从草鱼肝脏中首次克隆获得草鱼JAK2基因的片段序列。该片段序列长671 bp,编码223个氨基酸,氨基酸序列分析表明草鱼JAK2基因片段与其他物种的相似性在70%～91%之间;系统进化树显示,鱼类的JAK2独立聚成一支,草鱼与斑马鱼聚成一支,与鳜鱼和墨绿凹鼻鲀聚成的一支再聚成一支。实时荧光定量PCR分析表明,草鱼JAK2基因在肝脏、肌肉、脑、心脏、脾脏和肠系膜脂肪组织中均有表达,其中在肝脏组织中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),其次是肌肉、脑、脾脏和肠系膜脂肪组织,在心脏组织中表达量最低,且显著低于其他组织(P<0.05)。本研究为进一步研究草鱼JAK2基因的结构和功能奠定了基础。研究亮点:JAK2基因在鱼类上的研究报道甚少。本研究首次克隆了草鱼JAK2基因片段序列;且发现JAK2基因在肝脏组织中表达量最高,心脏组织中表达量最低,为草鱼JAK2基因的结构及其信号转导等生理功能的深入研究奠定了基础。     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。