伴随卫星分子的两种单组分双生病毒TbCSV和TYLCCNV之间的拮抗互作

为明确烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leafcurl China virus,TYLCCNV)在不同寄主中的相互作用,将含有TbCSV分离物Y35(Y35)和TYLCCNV分离物Y10(Y10)及伴随卫星DNAβ(Y35β或Y10β)侵染性克隆的农杆菌按不同组合接种本氏烟和心叶烟,定期观察植株症状。结果表明,当Y10和Y35同时伴随Y10β或Y35β时,接种植株60天后,在本氏烟中引起的曲叶症状减轻,而在心叶烟中曲叶症状减轻的现象在侵染早期较明显,且植株表现的症状与Y35+Y10β或Y35+Y35β引起的症状相似。PCR及Southern印迹检测结果显示,在本氏烟植株中,两种病毒及卫星在整个侵染过程中均能复制,且Y10和Y35的复制水平在侵染后期均降低。在接种后15天的心叶烟植株中能检测到所有DNA组分,但接种100天后在这些植株中均不能检测到Y10的复制,而Y35的复制水平与单独伴随卫星相比差异不大。表明TbCSV与TYLCCNV在症状形成和复制水平上存在拮抗互作,且这种拮抗作用随寄主不同表现各异。     

刺茄中分离的中国番茄黄化曲叶病毒及伴随的卫星DNA分子的全基因组结构

 从云南砚山刺茄(Solanum aculeatissimum)上分离到病毒分离物Y322,全序列测定表明,Y322 DNA-A全长2 730个核苷酸,共编码6个ORF。基因组比较发现,Y322 DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)各分离物的同源性最高(88.3%~99.2%),而与其它双生病毒的同源性均在79.6%以下,表明Y322是TYLCCNV的一个分离物。利用DNAβ的特异性引物在Y322中扩增到DNAβ分子(Y322 β),序列分析表明,其全长1 331个核苷酸,与TYLCCNV伴随的DNAβ的同源性最高,达75.1%~93.1%,而与已报道的其它种类的DNAβ的同源性均低于55.4%。这是首次在刺茄中检测到中国番茄黄化曲叶病毒。     

侵染曼陀罗的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNAβ全基因组结构特征

 从云南大理曼陀罗上采集到病毒分离物YN72,症状表现为叶脉增厚、叶片褪绿、植株矮化。全序列测定表明,YN72DNA-A全长2739个核苷酸。基因组比较发现,YN72DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒分离物(TYLCCNV-[Y43])同源性最高(93.4%),与中国番茄黄化曲叶病毒烟草分离物(TYLCCNV-[Y5])的同源性次之(92.9%),而与亚洲地区的其它双生病毒的同源性均在90%以下,表明曼陀罗中的分离物YN72是TYLCCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ的特异性引物beta01和beta02,在YN72中PCR扩增到DNAβ分子。序列分析表明,YN7213全长1335个核苷酸,在其互补链上编码1个有功能的ORF(C1)。YN72β的全序列与TYLCCNV分离物卫星分子Beanβ和Y297β的同源性最高,分别为99.8%和99.3%;与其它所比较的DNAβ的同源性均低于80.6%。系统进化树研究表明,YN72卫星分子DNAβ与其辅助病毒是共同进化的。     

2种单组份双生病毒与异源卫星DNA的互作

 烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV) Y35分离物(Y35)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV) Y10分离物(Y10)是从云南烟草上分离的2种单组份双生病毒,分别伴随卫星DNAβ(Y35β及Y10β)分子。将Y35和Y10分别伴随其同源或异源卫星(Y35β或Y10β)接种本氏烟和心叶烟,症状观察表明,无论Y10还是Y35伴随异源卫星DNAβ时引起的症状均与其伴随同源DNAβ引起的症状明显不同,且Y10β伴随Y35致病性最强。Southern印迹结果表明,Y10β及Y35β均可被异源辅助病毒稳定复制,但其复制水平明显低于伴随同源病毒时的水平,且植株中病毒和卫星的积累量并不完全与症状严重程度直接相关。     

甘肃省二斑叶螨地理种群的遗传分析

为探讨甘肃省二斑叶螨Tetranychus urticae种群遗传多样性及遗传分化,通过mtDNA-COI基因DNA条形码技术对采自甘肃省8个不同生境35个二斑叶螨地理种群的582个样品进行序列分析及地理种群的遗传分化分析。结果表明,获得二斑叶螨mtDNA-COI基因片段大小为424 bp,其中保守序列336个,变异位点66个,简约信息位点45个,单突变位点21个;碱基(A+T)含量明显高于(C+G)含量,有明显的A/T碱性偏倚性;在35个地理种群中共检出16个单倍型,单倍型指数为0.906;Mantel检测结果表明种群间的遗传距离与地理距离无显著相关性;35个地理种群间的遗传分化指数Fst为0.012,种群间变异为1.200。表明二斑叶螨的遗传变异主要来自于种群内部,种群间还未发生明显的遗传分化。     

二斑叶螨对阿维菌素抗性的CAPS标记

为了实现二斑叶螨Tetranychus urticae Koch对阿维菌素抗药性的快速检测,本研究建立了一种叶螨对阿维菌素抗药性的快速分子检测技术,即酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)标记技术,检测二斑叶螨谷氨酸门控氯离子通道(Glu Cl3)基因片段上G326E的突变频率,并采用琼脂浸叶法测定田间5个种群对阿维菌素的抗药性。结果表明,北京密云、顺义、昌平、浙江宁波和海南吉阳5个种群对阿维菌素的抗性倍数分别达1 155.63、1 317.10、844.19、314.95和1 799.69倍,均为极高抗性水平;CAPS检测发现我国二斑叶螨抗性基因存在G326E位点突变,但在供试的5个不同种群中突变频率变异很大,其中北京昌平种群G326E突变频率高达90.00%,密云和顺义种群均为26.67%,浙江宁波种群为5.00%,而海南吉阳种群不存在该位点的突变。表明该CAPS标记还需与其它抗性机制或检测技术结合来实现叶螨对阿维菌素抗性的早期检测和预警。     

海南红麻曲叶病的病原检测与鉴定

 红麻曲叶病是2012年在海南省海口市发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲、叶脉肿大、叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示,该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物(HN08)基因组仅含A组分(DNA-A),其全长为2 738 nt,与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)各分离物的相似性均大于89.0 %,其中与中国各分离物的相似性均大于99.0 %。该病毒分离物也伴随有β卫星分子,其全长为1 346 nt,与CLCuMuV各分离物伴随的β卫星分子(CLCuMuB)序列相似性大于83.0 %,其中与分离物Fz1的序列相似性最高,为99.7 %。构建了HN08 DNA-A及其β卫星分子侵染性克隆,通过农杆菌注射接种红麻,接种后30 d,HN08 DNA-A及其β卫星分子混合接种的红麻植株新出叶片开始产生曲叶症状;接种后60 d,二者混合接种的植株大部分叶片表现为严重的曲叶症状,且与田间自然病株症状相同,而二者各自单独接种的红麻植株没有产生明显的症状。PCR及Southern blot检测进一步证实这些症状是由HN08 DNA-A及其β卫星分子的共同侵染引起的。因此,海南红麻曲叶病是由CLCuMuV及其伴随的β卫星分子(CLCuMuB)共同侵染引起的。本文首次报道了红麻是CLCuMuV自然新寄主。     

烟草赤星病菌对嘧菌酯抗性突变体的诱导及其生物学特性

为评价烟草赤星病致病菌链格孢Alternaria alternata对嘧菌酯的抗性风险,以敏感菌株J6为试材,通过菌丝药剂驯化和分生孢子紫外诱变诱导抗性突变体,并对抗性突变体的生物学特性进行了研究,同时对抗性突变体与敏感菌株线粒体的细胞色素b基因 (cyt b) cDNA序列全长进行了测序分析。结果表明:经药剂驯化未获得抗性突变体,而紫外诱变共获得7株抗性突变体,突变频率约为0.007%,抗性水平分别为5.27、8.28、25.28、12.82、6.14、9.28和52.91倍。适合度研究表明,抗性突变体与敏感菌株的分生孢子萌发能力及致病力相当,但分生孢子产生量均高于敏感菌株,菌丝生长速率除突变体6-1外均快于敏感菌株。cyt b基因cDNA序列分析表明:有4株抗性突变体在不同位点上发生了核苷酸突变,其中突变体6-7 cyt b的249位和871位碱基由T突变为C,但其编码的氨基酸未发生突变;突变体6-8 cyt b的734位碱基由T突变为C,引起所编码的245位丙氨酸突变为缬氨酸 (V245A);突变体6-9 cyt b的510位碱基由T突变为A,所编码的170位由精氨酸替代了丝氨酸 (S170R);突变体6-11 cyt b的732位碱基由T突变为A,所编码的244位由苯丙氨酸替代了亮氨酸 (L244F),其776位碱基由T突变为C,所编码的259位由丙氨酸替代了缬氨酸（V259A）,其1 156位碱基由A突变为G,所编码的氨基酸未发生变化。研究结果初步表明,烟草赤星病菌对嘧菌酯存在潜在的抗药性风险,其cyt b基因的点突变与其对嘧菌酯的抗药性有关。     

trnH-psbA序列作为DNA条形码在苍耳属杂草鉴定中的应用

以trn H-psb A序列作为DNA条形码,对从国外截获的9种苍耳属杂草及1种国内苍耳进行物种鉴定研究。采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒进行总DNA的提取,应用通用引物对其trn H-psb A基因进行PCR扩增,测序得到10种苍耳属杂草的trn H-psb A序列,并利用MEGA 7.0软件进行比对分析构建系统进化树。结果显示:苍耳属杂草trn H-psb A基因序列共有543个位点,其中有53个变异位点,31个变异信息位点,22个单突变位点,30个碱基缺失;种间遗传距离为0~0.093,种内无遗传差异;进化树显示10个苍耳物种均处于独立分支,能够利用该条形码对苍耳属杂草进行区分鉴定。     

海南省田间稻瘟病菌中AvrPiz-t基因位点变异

为评估在水稻育种中被广泛利用的广谱抗稻瘟病基因Piz-t的有效性,对不同年份分离自海南省陵水黎族自治县和三亚市水稻的273株田间稻瘟病菌株中的AvrPiz-t位点变异及其与菌株致病性的相关性进行系统研究。结果表明,海南省田间菌株中无毒基因AvrPiz-t位点的变异频率为0～100.00%,陵水黎族自治县菌株中的变异频率远远高于三亚市菌株。在菌株中共鉴定到3种AvrPiz-t位点变异类型,分别为基因位点完全缺失、DNA重复元件MGR583在基因位点启动子区-10 bp上游和编码区218 bp下游插入。所有AvrPiz-t位点变异的菌株对携带Piz-t抗病基因的单基因水稻系IRBL-11均表现出强的致病性。陵水黎族自治县菌株中AvrPiz-t位点的变异频率呈逐年增加趋势,2021年94株菌株中AvrPiz-t位点的变异频率为100.00%,其中51.06%的菌株变异是MGR583在启动子区-10 bp上游插入,表明DNA重复元件MGR583在AvrPiz-t位点插入是AvrPiz-t从无毒到有毒进化的重要机制之一。     

四川米易赛葵上粉虱传双生病毒的分子鉴定及复合侵染检测

为了明确四川米易赛葵上的双生病毒种类及复合侵染情况,基于滚环扩增PCR（RCA-PCR）技术,利用双生病毒DNA-A、DNA-B及卫星DNA的通用引物对四川米易表现黄脉症状的12个赛葵样品进行了检测,并对其序列进行分析。双生病毒的检出率高达92%;共检出云南赛葵黄脉病毒（Malvastrum yellow vein Yunnan virus,MYVYNV）、赛葵黄脉病毒（Malvastrum yellow vein virus,MYVV）及中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）等3种双生病毒,复合侵染率高达67%;11个阳性样品中共检测到两类卫星DNAβ分子,分别与MYVYNV伴随的DNAβ（MYVYNB-[Y160],98.4%～98.7%）和MYVV伴随的DNAβ（MYVB-[Y197],98.5%～98.7%）的序列相似性最高;未扩增到DNA-B及DNAα分子。表明病毒DNA-A与卫星DNAβ以病害复合体形式存在,且DNAβ可伴随异源辅助病毒。     

福建省烟粉虱不同地理种群遗传结构特征

为明确福建省烟粉虱种群遗传结构特征,基于福建省烟粉虱不同地理种群中40个代表性的线粒体COI基因序列,分析了种群遗传多样性、遗传分化及分子变异情况,并构建了单倍型系统发育树与网络图。结果显示:在590 bp长度的mt COI基因序列中有效位点558个,其中187个核苷酸位点存在变异;序列核苷酸中A、T、C、G含量分别为42.32%、24.36%、20.25%、13.06%,其中A+T的含量为66.68%,表现出明显的A+T偏向性;共检测出11个单倍型,其中Hap3、4、7、9、11为特殊单倍型;种群多样性指数为0.838,核苷酸多样性指数为0.093,表明遗传多样性水平较高;AMOVA分析表明种群遗传变异主要来自种群内,总种群遗传分化系数仅为0.027,种群遗传分化较低。表明福建烟粉虱种群基因交流未受地理距离明显影响,种群遗传分化不显著。     

瘿蚊科3种昆虫核糖体DNA的克隆及序列分析

瘿蚊科是双翅目昆虫中的重要类群?本研究对瘿蚊科3种昆虫—麦红吸浆虫?菊花瘿蚊和食蚜瘿蚊的核糖体DNA进行PCR扩增?克隆?测序及序列分析, 并对ITS-1在麦红吸浆虫4个地理种群中的遗传变异情况进行分析?结果表明, 从3种昆虫中获得的核糖体DNA序列包括:部分的18S rDNA(44 bp)?28S rDNA(37 bp), 全部的ITS-1(487~535 bp), 5.8S rDNA(121 bp)及ITS-2(336~352 bp)序列?3种昆虫ITS序列的碱基差异百分比在17.21%~29.59%之间, 共含有206个变异位点?ITS-1序列在麦红吸浆虫4个地理种群中比较保守, 只有4个变异位点, 单倍型多样性为0.311 7~0.796 5, 核苷酸多样性为0.000 6~0.002 2?本研究为今后瘿蚊科昆虫的分类鉴定?系统发育和遗传进化等相关研究提供了基础?     

北京及周边地区九个地理种群的亚洲小车蝗mtDNA ND6基因及其部分侧翼序列分析

为明确北京地区亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus Bey-Bienko的迁飞来源,选取包含完整线粒体DNA的ND6、tRNA-Thr基因及侧翼ND4L、CYTB基因部分序列作为目的片段,采用DNA序列法分析来自北京及周边省市9个地理种群155个亚洲小车蝗样本的序列碱基组成、种群遗传多样性、种群结构及单倍型网络进化等。结果表明:在目的序列中共检测到多态性位点16个,鉴定出单倍型20种,分别占碱基总数和总样品量的1.88%和12.90%;核苷酸多样性为0.0012,单倍型多样性为0.66,种群间遗传分化系数绝对值≤0.51,种群内个体间遗传变异占总变异的86.88%,各种群遗传变异与空间距离间无显著相关性,供试样本总体上遗传变异程度相对较低。北京密云种群鉴定出的独享单倍型H14由单倍型H10经2次突变获得,H10被锡林郭勒和乌兰察布种群共享;北京密云与河北滦平、围场及内蒙古乌兰察布种群间基因流Nm绝对值分别为3.749、1.387和0.912,均高于密云种群与其它种群间的Nm绝对值;结合亚洲小车蝗在北京及周边地区出现的先后时序可知,内蒙古锡林郭勒、乌兰察布及河北滦平、围场是北京地区亚洲小车蝗的最主要迁飞来源。     

侵染新疆加工番茄的中国番茄黄化曲叶病毒 DNA-A的基因组特征

 从新疆加工番茄上分离到病毒分离物XJ26-4,对其基因组DNA-A 全序列测定表明,XJ26-4 DNA-A 全长2 737 个核苷酸(GenBank 登录号:FN985163),具有典型的双生病毒基因组特征。进一步序列比较发现,XJ26-4 DNA-A 与中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)各分离物的同源性最高,达到91. 2% ~ 99. 5% ,而与其他双生病毒的序列相似性均在79. 5% 以下,表明XJ26-4 是TYLCCNV 的一个分离物。这是首次明确新疆加工番茄受到粉虱传双生病毒的侵染。     

江苏朱槿上分离到的木尔坦棉花曲叶病毒基因组结构特征分析

 2012年5月,江苏南京朱槿上出现一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片上卷、叶脉肿大、叶背伴有耳突、植株矮缩等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行研究,结果发现采集的46份典型症状样品体内均可以检测到粉虱传双生病毒,对其基因组DNA-A组分克隆测序后发现其全长2 736 bp,编码6个ORF,BLAST分析显示该病毒与木尔坦棉花曲叶病毒同源性最高(99.9%),是木尔坦棉花曲叶病毒的一个分离物。病样中同时还检测到伴随DNAβ卫星分子,测序结果显示该卫星全长1 346 bp,编码1个ORF,BLAST及聚类分析结果显示该β卫星与木尔坦棉花曲叶病毒β卫星同源性最高(99.7%),为木尔坦棉花曲叶病毒β卫星的一个分离物。这是木尔坦棉花曲叶病毒首次在长江流域的报道。     

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgNVF1的功能初步分析

苹果炭疽叶枯病是主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种苹果重要叶部病害,严重威胁着苹果树的生长。本研究从构建的苹果炭疽叶枯病菌T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力缺失的突变菌株A3083,采用hiTAIL-PCR方法克隆了该突变体T-DNA插入位点的右翼序列;通过与胶孢炭疽菌基因组序列比对分析,发现T-DNA插入位点位于1个预测的CGGC5_9603基因内,并将该基因命名为CgNVF1。CgNVF1基因全长2252 bp,含有2个内含子,编码709个氨基酸。CgNVF1定位于细胞质,在苹果炭疽叶枯病菌菌丝、分生孢子和附着胞中均有表达。通过构建CgNVF1敲除菌株和CgNVF1互补菌株,并结合表型分析,证实CgNVF1基因在苹果炭疽叶枯病菌附着胞形成及致病中具有重要的作用。     

绿针假单胞菌YL-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析

绿针假单胞菌YL-1对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用。采用转座子插入突变技术电转化绿针假单胞菌YL-1,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对3种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌Burkholderia glumae、解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora和胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovora抑菌效果显著下降的突变体,并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到YL-1染色体基因组上。利用质粒拯救技术克隆转座子插入位点基因、测序和生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌YL-1随机插入突变体库,筛选出7株对3种病原细菌抑制效果明显下降的突变体,但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株YL-1相同;PCR和Southern Blot试验结果表明绿针假单胞菌YL-1的7株突变体均是单拷贝;克隆到7个突变体插入位点的基因序列并测序,生物信息学分析结果表明其中6个突变位点是嗜铁素合成基因簇,1个突变位点是蛋白分泌基因sec Y。     

烟草花叶病毒及其弱毒株基因组的cDNA克隆和序列分析

 利用RT-PCR技术获得了覆盖整个烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)强毒株TMV-W、2个弱毒株TMV-017和TMV-152基因组(RNA)的cDNA克隆。序列测定结果表明,强、弱毒株全长均为6 395个核苷酸,具有4个开放阅读框(open readingframe,ORF),分别编码126、183、30、17.6 kDa蛋白。TMV-W和普通株系TMV-U1的基因组同源率达到98%,TMV-W为普通株系。TMV-017、TMV-152基因组发生变异的部位主要在126/183 kDa ORF中。和TMV-W相比,TMV-017仅在126 kDa蛋白ORF中有18个碱基发生变异,其中10个碱基引起氨基酸的改变;而TMV-152在183 kDa ORF中有16个碱基发生变异,其中有11个引起氨基酸的改变。TMV-017和TMV-152有11个共同变异的碱基,其中有8个引起氨基酸的变异。TMV-152在30 kDa ORF中有1个碱基发生变异而引起氨基酸的改变。其它区域,三者完全相同。