橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

木薯MeGWD3基因克隆及植物表达载体构建

[目的]克隆木薯葡聚糖水合双激酶(MeGWD3)基因并构建其植物表达载体,为开展木薯MeGWD3基因调控及功能研究提供参考.[方法]采用RT-PCR从木薯华南124(SC124)中克隆MeGWD3基因,对其进行序列分析,并将其连接至改造的pCAMBIA2300载体,构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结果]MeGWD3基因全长3522 bp,编码1173个氨基酸.经序列比对,发现MeGWD3基因序列与木薯Phytozome数据库中公布的GWD基因(cassava4.1_000497m)只存在2个碱基差异,同源性高达99.94%;与NCBI数据库中收录的木薯GWD基因(JN618460)同源性高达99.00%,与蓖麻GWD基因(XM 002518566)同源性达86.00%;成功构建植物表达载体pCAMBIA2300-MeGWD3.[结论]成功构建的植物表达载体pCAMBIA2300可用于MeGWD3基因功能及木薯淀粉代谢研究.     

苎麻生长素结合蛋白BnABP1与GFP融合在烟草中的表达

运用已克隆的苎麻生长素结合蛋白BnABP1基因cDNA及植物表达载体pCAMBIA1300 GFP,构建了35S启动子控制的苎麻BnABP1基因编码区段与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达重组体(pCAMBIA1300 GFP BnABP1)。通过根癌农杆菌介导法将其转化烟草WS38,经抗性筛选和PCR检测获得了转基因烟草。对转基因烟草细胞进行荧光显微镜观察,发现在细胞质膜和内膜系统上都有较强烈的荧光信号,进一步证明苎麻生长素结合蛋白ABP1已结合在细胞的膜系统上。     

EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

水稻OsOle1基因的克隆及其遗传转化

[目的]克隆水稻OsOle1基因并对其进行遗传转化。[方法]通过RT-PCR方法对OsOle1基因进行克隆,将克隆出的OsOle1基因连接到pCAMBIA1300上构建其超表达载体,并通过农杆菌介导对水稻愈伤进行了遗传转化。[结果]克隆出的OsOle1基因全长498bp,编码165个氨基酸,成功构建了其超表达载体Ub：：OsOe1-GUS,最终得到了转基因株系。[结论]为OsOle1基因的功能研究奠定了基础。     

水稻OsOle1基因的克隆及其遗传转化

[目的]克隆水稻OsOle1基因并对其进行遗传转化。[方法]通过RT-PCR方法对OsOle1基因进行克隆,将克隆出的OsOle1基因连接到pCAMBIA 1300上构建其超表达载体,并通过农杆菌介导对水稻愈伤进行了遗传转化。[结果]克隆出的OsOle1基因全长498bp,编码165个氨基酸,成功构建了其超表达载体Ub：：OsOe1-GUS,最终得到了转基因株系。[结论]为OsOle1基因的功能研究奠定了基础。     

多聚磷酸盐激酶(PPK)基因植物表达载体的构建

[目的]枸建融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK.[方法]根据GenBank中登录的大肠杆菌PP基因序列(L03719)设计引物,以E.coli DH5α基因组DNA为模板,通过PCR扩增得PPK基因,然后用In-Fusion@HD Cloning Kit将PPK基因克隆到pCAMBIA1302载体的Nco Ⅰ酶切位点.[结果]序列测定结果显示,pCAMBIA1302-PPK含有约2.0kb的PPK基因片段,说明PPK基因已插入植物表达载体pCAMBIA1302的绿色荧光蛋白基因前.[结论]成功构建了融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK.     

玉米ZmCIPK6基因的克隆及植物表达载体的构建

根据MaizeDGB数据库中ZmCIPK6基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK6基因。ZmCIPK6基因c DNA全长1 739 bp,5′-非编码区长281 bp,3′-非编码区长111 bp,编码区长1 347 bp,编码448个氨基酸,预测分子量为48.8 KDa,等电点为9.14。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK6与高粱SbCIPK6同源性较高。根据ZmCIPK6的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pMD18-T-ZmCIPK6为模板,PCR扩增ZmCIPK6基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建成该基因的植物表达载体。经PCR检测及测序鉴定,表明成功构建了ZmCIPK6基因的植物表达载体,为进一步遗传转化研究基因的功能奠定基础。     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析

[目的]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据.[方法]通过E-CRISP在OsC3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAM-BIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况.[结果]在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'.将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2).通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株.CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止.[结论]水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料.     

大麦黄矮病毒运动蛋白形成同型二聚体的功能研究

[目的]利用荧光双分子互补技术研究大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-PAV,MP）形成二聚体的可能性,并研究MP同型二聚体与病毒运动之间的关系。[方法]将双分子荧光互补载体中包含多克隆位点、35S启动子及终止子的DNA片段构建到拷贝数较高的植物表达载体pCAMBIA1300上,然后以BYDV-PAV的全长cDNA为模板,根据GenBank中登记的BYDV-MP的基因序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因片段BYDV-MP,克隆到经过改造的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-NE、pCAMBIA1300-CE上,得到了重组的双分子荧光互补载体。电击转化农杆菌,利用农杆菌渗透注射技术注射到烟草叶片,荧光显微镜下观察植物体内的蛋白互作现象。[结果]农杆菌渗透注射后,2～5d观察双分子荧光互作现象,MP蛋白互作组及正对照组叶片产生黄色荧光,负对照组未有荧光现象。[结论]BYDV-MP在植物体内形成同源二聚体,该研究结果为进一步深入开展BYDV运动过程和机理等研究提供了理论依据。     

大麦黄矮病毒运动蛋白形成同型二聚体的功能研究

[目的]利用荧光双分子互补技术研究大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-PAV,MP）形成二聚体的可能性,并研究MP同型二聚体与病毒运动之间的关系。[方法]将双分子荧光互补载体中包含多克隆位点、35S启动子及终止子的DNA片段构建到拷贝数较高的植物表达载体pCAMBIA1300上,然后以BYDV-PAV的全长cDNA为模板,根据GenBank中登记的BYDV-MP的基因序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因片段BYDV-MP,克隆到经过改造的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-NE、pCAMBIA1300-CE上,得到了重组的双分子荧光互补载体。电击转化农杆菌,利用农杆菌渗透注射技术注射到烟草叶片,荧光显微镜下观察植物体内的蛋白互作现象。[结果]农杆菌渗透注射后,2～5d观察双分子荧光互作现象,MP蛋白互作组及正对照组叶片产生黄色荧光,负对照组未有荧光现象。[结论]BYDV-MP在植物体内形成同源二聚体,该研究结果为深入开展BYDV运动过程和机理等研究提供了依据。     

橡胶树HbHMGR1基因克隆及其愈伤组织转化

[目的]克隆橡胶树HbHMGR1基因,转化橡胶树易碎愈伤组织,为橡胶树遗传转化和品种改良打下基础.[方法]根据已经报道的HbHMGR1基因序列（NCBI登录号X54659.1）设计特异引物,通过RT-PCR克隆HbHMGR1基因,构建pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1植物表达载体.再用EHA105（携带pCAMBIA2301-35 S-HbHMGR1,内含NPTⅡ和uidA基因）侵染橡胶树易碎愈伤组织,数月筛选后对抗性易碎愈伤组织系进行GUS染色和分子检测.[结果]成功克隆了HbHMGR1基因,双酶切重组质粒、重组质粒的PCR扩增结果证明成功地构建了该基因的植物表达载体pCAMBI-A2301-35S-HbHMGR1.侵染后抗性橡胶树易碎胚性愈伤组织GUS检测为蓝色,且分子检测呈现阳性,共获得15个抗性易碎愈伤组织系.[结论]橡胶树HbHMGR1基因在愈伤组织阶段开始表达,有效提高了HbHMGR1基因在橡胶中的表达量.     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因表达载体的构建

[目的]构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[方法]利用长片段PCR在抗白叶枯病水稻品种扎昌龙中扩增长10.6 kb的候选基因,将其通过Asc I单酶切克隆至植物表达载体pCAMBIA1300中,并对阳性克隆进行质粒PCR、酶切检测和测序分析。[结果]试验成功构建了水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[结论]该研究为进一步研究Xa31(t)基因的功能奠定了基础。     

利用重组PCR技术构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体

[目的]构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体。[方法]利用含有GFP基因和Nos终止子的A2GFP质粒和舍有普遍适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子（Ptrpc）的pUCATPH质粒,通过重组PcR技术构建Ptrpc-GFP一Nos重组基因,然后插入到农杆菌质粒pCAMBIA1300的多克隆位点,构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体,并对其进行酶切和测序鉴定。[结果]通过重组PcR技术,仅通过Ptrpc启动子基因扩增、GFP—Nos基因扩增、Ptrpc—GFP一Nos重组基因扩增、1次双酶切、1次连接和转化,就成功地构建了适合真菌ATMT转化的GFP基因的表达载体pCAMBIA1300-PGN,不需要构建中间载体,并大大简化了连接步骤。该载体经过PCR、酶切和测序鉴定,结构正确。连接准确,序列无误。[结论]该研究为真菌ATMT突变体的构建和快速检测奠定了基础。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。