南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。     

南极磷虾体内胰蛋白酶的纯化及性质研究

以南极磷虾(Euphausia superb)为研究对象,通过硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析等方法,从南极磷虾体内分离纯化出胰蛋白酶。其纯化倍数为5.44倍,比活力为38.3 U/mg,得率为26%。SDS-PAGE电泳结果显示,该酶的分子质量为28 ku。蛋白酶最适温度为37℃、最适pH为7.5,Mg2+、Ca2+、Mn2+对南极磷虾蛋白酶具有激活性,Zn2+、Cu2+、Fe3+具有酶活抑制性,其中Cu2+的抑制性最强。酶的动力学实验结果表明,以BApNA为底物测得Km为0.073 mmol/L,Vmax为1.44×10-2mmol/L·s,kcat为0.6S-1,kcat/Km为8.22×103,PMSF作为蛋白酶抑制剂,对南极磷虾蛋白酶作用机制为不可逆抑制。     

日本鳗鲡肠道蛋白酶的分离纯化及其酶学性质研究

【目的】从日本鳗鲡(Anguilla japonica)肠道中分离纯化蛋白酶并分析其酶学性质,为日本鳗鲡饲料的科学研制提供理论依据。【方法】通过硫酸铵沉淀分级分离及Sephadex G-100和Sephadex G-75两级凝胶柱层析纯化日本鳗鲡肠道蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE鉴定蛋白酶纯度和亚基分子质量,利用凝胶层析法测定酶的分子质量,用等电聚焦电泳法测定酶的等电点,并研究以酪蛋白为底物时蛋白酶催化反应的动力学参数及pH、温度、金属离子和修饰剂对蛋白酶活力的影响。【结果】日本鳗鲡肠道蛋白酶亚基分子质量为65.3ku,酶分子质量为260.3ku,等电点为8.23;该蛋白酶的最适pH为8.2,最适温度为55℃,米氏常数(Km)为4.832mg/mL,最大反应速度(Vmax)为0.269U/min。日本鳗鲡肠道蛋白酶在pH为6.6~9.0时表现稳定,在20~55℃时具有较好的热稳定性,在60℃以上稳定性迅速下降。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Hg2+对日本鳗鲡肠道蛋白酶的活力表现出不同程度的抑制作用,其中以Hg2+的抑制作用最强,1 mmol/L Hg2+可使酶活力丧失87.63%;而Fe2+有激活作用,5mmol/L Fe2+可使酶活力提高134.53%。修饰剂EDTA、对氯汞苯甲酸(pCMB)和Cys对酶活力没有影响,苯甲酰基磺酰氟(PMSF)和二硫苏糖醇(DTT)对酶活力则有不同程度的抑制作用。【结论】日本鳗鲡肠道蛋白酶由4条相同肽链组成,属于丝氨酸蛋白酶类,二硫键是维持其活性所必需的,酶活力易受环境中酸碱度、温度和金属离子调控。     

多氯联苯降解酶的分离纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵盐析浓缩、透析、Sephdex G-150凝胶过滤层析,对表皮葡萄球菌产生的多氯联苯(PCBs)降解酶进行分离纯化.粗酶经30%～80%饱和度硫酸铵沉淀法纯化后比酶活可提高到442.29 U/mg;经透析后的比酶活可提高到480.75 U/mg;最后经凝胶层析法纯化后的比酶活可提高到6 903.57 U/mg...     

枇杷果肉过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

枇杷果肉制成丙酮粉,通过硫酸铵沉淀分级分离、透析、DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化,获得两个酶活力峰,第二活力峰的酶制剂经过PAGE和SDS-PAGE电泳获得单一纯的过氧化物酶(PODⅡ),纯酶比活力为710.5U/mg。酶亚基分子量为22.6kDa,等电点pI为3.6。酶的动力学研究表明:酶的最适pH为5.0,在pH2.6～10区域较稳定;酶最适温度是35℃,对热敏感,高于45℃以上酶的稳定性差。酶对愈创木酚和H2O2的表观Km值分别为20.58和12.04mmol/L,以愈创木酚为底物时,酶比活力最大,其次是苯酚、邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚,酶未能催化以焦性没食子酸为底物的氧化反应。Al3+、Mn2+、Zn2+和Hg2+对酶有抑制作用,Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Ba2+和Pb2+对酶有激活作用;半胱氨酸等12种化合物对酶活力均有不同程度的抑制作用,在防止或减轻枇杷采后的酶促褐变中将起到重要的作用。     

黑曲霉变种RM48 α 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究

    经硫酸铵沉淀、疏水柱层析和分子筛层析,从黑曲霉变种RM48(Aspergillus niger v.Tiegh RM48)固体发酵后的浸提液中分离纯化了α-半乳糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,此酶蛋白的分子量约为108 kDa.酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度是60℃,耐热温度为40℃:最适反应pH为4.5,在pH 3.0～6.0之间保持90%以上的酶活性;在实验的金属离子范围内,所有金属离子对黑曲霉变种RM48α-半乳糖苷酶均有抑制作用,其中Cu2+和Fe2+抑制作用最为显著,Li2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Ca2+,Mg2+和Co2+对酶活性有轻微的抑制作用.在pH 4.0和60℃反应条件下此酶的Km为7.37mm01·L-1,Vmax为5618 IU·mg-1·min-1.成熟酶蛋白N端序列为DEKAYSPCYY,与已报道的α-半乳糖苷酶蛋白无同源性.     

莲藕过氧化物酶的分离纯化及性质研究

经40%-85%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析纯化,得到莲藕过氧化物酶（POD）电泳纯制品.该酶纯化倍数为39.77倍,回收率为11.76%.酶学性质和动力学性质研究表明,该酶最适pH为5.0;最适温度为35℃;以不同浓度的过氧化氢与莲藕POD在25℃、pH5的条件下反应,测得其Km值为9mmol/L.CuSO4和ZnSO4对莲藕POD活性有激活作用;BaCl2、MgCl2及SDS对其活性影响不大;Na2SO4、Li2SO4、KCl和NaCl对POD活性有一定的抑制作用;MnSO4和FeSO4对POD活性有较强的抑制作用;ASA能完全抑制POD的活性.     

环状芽孢杆菌A6产生的果胶酶和木聚糖酶分离纯化及酶学性质

寄生于南方亚麻茎杆上的环状芽孢杆菌发酵产生的果胶酶和木聚糖酶经采用(NH4)_2SO_4沉淀与半透膜透析,CM-Sephadex C-50凝胶离子交换柱层析,Sephadex G-100凝胶柱层析分离纯化.经鉴定果胶裂解酶和木聚糖酶基本达电泳纯,果胶裂解酶两个亚基的相对分子质量分别为32253,27400,木聚糖酶两个亚基的相对分子质量分别为86 489,57422;果胶裂解酶和木聚糖酶最适反应温度为45℃;果胶裂解酶最适反应pH值为10.5,木聚糖酶最适反应pH值为7;对果胶裂解酶而言,K~ ,Mg~(2 )有轻度的抑制作用.Fe~(2 ),Cu~(2 )有强抑制作用,Ca~(2 )有一定的激活作用;对木聚糖酶,K~ ,Mg~(2 )有轻微抑制作用,Cu~(2 )有强抑制作用,Ca~(2 )和Fe~(2 )有一定的激活作用.     

南极磷虾酶解工艺的研究

以水解度为指标,探讨中性蛋白酶水解南极磷虾的效果,通过试验筛选木瓜蛋白酶和枯草杆菌中性蛋白酶酶解南极磷虾的工艺条件。结果表明:南极磷虾自溶水解度为28.63%,添加中性蛋白酶可显著提高南极磷虾水解度;木瓜蛋白酶酶解工艺为酶解温度50℃、pH值7.5、酶解时间5 h、酶添加量0.3%,水解度达(42.17±0.17)%;枯草杆菌中性蛋白酶酶解工艺为酶解温度50℃、pH值7.5、酶解时间5 h、加酶量0.4%,水解度达(41.86±0.23)%。     

产甘露聚糖酶细菌的分离鉴定、酶的部分纯化及酶学性质研究

以魔芋粉为惟一碳源作为富集条件,利用刚果红染色法从玉米地土壤中筛选到1株产β-甘露聚糖酶的菌株,经摇瓶培养后其酶活力达到101 U/mL。经形态观察及16S rDNA序列分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和疏水层析对酶进行了部分纯化。对酶的酶学性质研究发现,该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0;在45~55℃时酶的稳定性较好,保温30 min后其残留活性在80%以上,在pH4.5~5.5时酶的稳定性较好,保持30 min后其残留活性在80%以上。     

响应面法优化南极磷虾酶解液的脱氟工艺

[目的]利用响应面法对南极磷虾酶解液的脱氟工艺条件进行优化,为南极磷虾在食品工业中开发应用提供技术依据.[方法]在单因素试验的基础上,以脱氟率(Y)为响应值,选择醋酸钙添加量(A)、初始pH(B)、反应温度(C)为自变量,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究各自变量及其相互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响,并分析酶解液中主要营养成分的变化.[结果]建立二次回归方程:Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2;醋酸钙添加量、初始pH及醋酸钙添加量与反应温度的交互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响极显著(P<0.0l).南极磷虾酶解液脱氟工艺的最佳条件为:醋酸钙添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反应时间140 min、反应温度30.24℃,在此条件下的脱氟率为(84.15±1.37)%,与理论预测值(8537%)的相对误差较小.在最佳条件下脱氟后,酶解液中总氮和氨基态氮含量分别损失3.11%和2.52%,反应前后含量变化不显著(P>0.05).[结论]采用响应面法优化得到的南极磷虾酶解液脱氟工艺具有操作简单、对酶解液的营养成分影响较小等优点,有较高的可行性;建立的回归模型可用于实际预测.     

基于现场水箱试验的南极磷虾耐盐性研究

为了解南极磷虾Euphausia superba对盐度变化的适应能力,基于海上水箱试验,采用渐变式(16.2~54.5)和急变式(15.9~55.2)两种不同的盐度变化方法对南极磷虾个体在不同盐度下行为状态进行观察和记录,分析了南极磷虾的耐盐性。结果表明:南极磷虾在低盐度下的适宜临界盐度为26左右,极限临界盐度为16左右;南极磷虾在高盐度下的适宜临界盐度为43左右,极限临界盐度为55左右。研究表明,南极磷虾对盐度的变化具有一定的适应能力,但适应范围有限。     

国内南极磷虾产业专利技术状况分析

为探讨国内南极磷虾产业专利技术的发展现状及存在的问题,运用文献计量法和文本挖掘法对在中国申请的南极磷虾专利信息进行挖掘和分析,包括总体概况、申请趋势与技术生命周期分析、专利空间和技术分布、申请人以及专利价值分析等。结果表明,国内南极磷虾专利技术研发处于发展期,专利技术层级有所提高,但国外申请人拥有的南极磷虾专利价值较高。应注重提高国内南极磷虾专利的质量,开展南极磷虾产业规划及战略的研究,从而为整个产业链的发展提供参考。     

山药蛋白酶解液的分离纯化

以山药(Dioscorea opposite Thumb.)为原料,选取碱性蛋白酶酶解山药蛋白粗提物制备山药蛋白酶解液。分别采用纤维素DE-52阴离子交换层析和Sephadex G-50凝胶层析,对酶解制备的山药蛋白酶解液进行分离纯化。结果表明:经过纤维素DE-52阴离子交换层析,得到4个吸收峰,收集每个峰组分,其单位质量的还原能力分别为峰2(P2)>峰1(P1)>峰3(P3)>峰4(P4)。采用Sephadex G-50凝胶分别用蒸馏水和Tris-HCl缓冲液对P1和P2组分继续分离纯化,均能得到2个吸收峰(组分)。     

重组米曲霉丝氨酸羧肽酶O的性质鉴定及脱苦应用研究

为了研究羧肽酶在蛋白水解及对蛋白水解物脱苦中的重要作用,利用毕赤酵母表达系统对米曲霉(Asperigillus oryzae)羧肽酶O(carboxypeptidase O,OcpO)进行表达.重组米曲霉羧肽酶O(rOcpO)经过分子筛和离子柱纯化,对其进行脱糖基化及酶学性质的检测研究.结果表明,该蛋白酶是以糖蛋白的形式进行表达,分子量约为74 ku,脱糖基化后的相对分子质量约为56 ku,产量约为20.4 nKat/mL.该蛋白酶是一种酸性蛋白酶,最适pH值为4.0,且在pH 3.0～6.0时保持稳定;最适温度约为40℃,具有良好的热稳定性,在60℃孵育1h后仍能保持63％的酶活;PMSF能够显著抑制该酶酶活,证明其为丝氨酸羧肽酶.通过rOcpO对大豆蛋白和酪蛋白的Alcalase蛋白酶水解物的进一步水解研究发现,rOcpO水解对两种水解液的苦味均有明显减轻,并且水解度有明显升高.     

Bacillus subtilis Z-3菌株纤溶酶的分离纯化研究

为获取微生物源溶栓药物,从土壤中获得产纤溶酶活性较高的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-3。从Z-3菌株的发酵液中提取纤溶酶,利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化。分离纯化得到1个单一组分(BSFE-1),SDS-PAGE电泳检测为单一条带,BSFE-1表观分子量为48 kDa,等电点为10.5,属丝氨酸蛋白酶类,纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性BSFE-1的比活力为4 494.099 U/mg,BSFE-1在4~50℃和pH 4~11之间活性较稳定。     

石楠拟盘多毛孢致病毒素的初步分离纯化

为了获得引起草莓根腐病的石楠拟盘多毛孢(Pestalotiopsis photiniae)产生的致病毒素组分,利用中压硅胶柱层析、高效液相C-18制备柱层析和sephadex LH-20层析对粗毒素进行了分离纯化,以离体叶盘针刺法检测分离所得组分的致病活性。结果显示:经中压硅胶柱层析和高效制备液相色谱得到了FrⅢ1和FrⅢ2两个组分,其中FrⅢ1有较强活性;用sephadex LH-20对FrⅢ1进一步纯化后又得到了两组活性组分FrⅣ1-2和FrⅣ3-4,其中组分FrⅣ3-4的活性明显强于组分FrⅣ1-2;HPLC分析发现这两组组分又分别含有2个和5个组分,7个组分均在C-18柱层析过程中出峰时间较早,说明该毒素的极性较大。     

木瓜蛋白酶超声法提取工艺及其酶学性质

结果表明:最佳提取工艺条件为超声波功率300 W,超声处理时间200 s,果浆质量分数30%;经超声波强化提取,酶活力提高到原先的1.71倍;在以酪蛋白为底物、pH 7.5和40℃条件下,木瓜蛋白酶的Km值和Vm值分别为1.4709 mg.mL-1和5.5252μg.mL-1.m in-1;最适温度为70-80℃,最适pH值为5.4-6.6;该酶在40℃以下,pH为5.4-6.0时酶活力相对稳定;EDTA、Cys和Vc对酶活力具有激活作用,CuSO4和ZnC l2具有抑制作用,而KC l、NaC l、CaC l2、MgSO4对酶活力的影响不大.