多菌灵抗性基因转化哈茨木霉的研究

将含有多菌灵抗性基因的质粒pRB129转化到哈茨木霉原生质体,转化率为6～7/3μgDNA/2×105原生质体。转化子可以在1000μg·mL-1多菌灵浓度下正常生长,并具有有丝分裂稳定性,多菌灵抑制木霉和木霉转化子的微管蛋白的体外聚合作用,5～10μg·mL-1多菌灵对木霉微管蛋白聚合的抑制率约为木霉转化子抑制率的2.5～3.5倍。     

聚乙二醇介导咖啡炭疽菌遗传转化体系的建立

[目的]建立高效制备咖啡炭疽菌原生质体及聚乙二醇(PEG)介导的遗传转化体系的方法,为开展咖啡炭疽菌的致病分子机理研究打下基础.[方法]以咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2为试验材料,通过PEG介导原生质体转化法将含有氯嘧磺隆标记和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的质粒pCB1532-G转入BSC2-2原生质体中,对获得的转化子进行遗传稳定检测、PCR分子检测和激光共聚焦显微观察.[结果]BSC2-2对氯嘧磺隆的耐受浓度为200.0 mg/L.最佳遗传转化体系为:28℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌丝2 h,收集原生质体,再经MTC缓冲液冲洗重悬后将质粒pCB1532-G转入原生质体,在RM培养基中混匀再生,获得转化子.GFP基因的PCR扩增和分生孢子荧光观察结果表明,GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中.转化子与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病力上无明显差别,表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中稳定遗传.[结论]成功建立了PEG介导的咖啡炭疽菌遗传转化体系,获得与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病性上无明显差别的转化子,为后续研究咖啡炭疽菌的基因功能和致病机理提供技术支持.     

西瓜枯萎病菌和哈茨木霉的GFP标记及根部动态定殖比较

为明确西瓜枯萎病菌和生防哈茨木霉在西瓜根部动态定殖的差异,采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法,将携带绿色荧光蛋白基因的pCT74质粒分别与尖镰孢菌西瓜专化型和哈茨木霉M3菌株的基因组整合获得相应的转化子;将转化子接种于土壤,利用激光共聚焦显微镜示踪并比较两菌株转化子对西瓜幼苗根部的侵染动态过程。结果表明,转化子连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度稳定,能够稳定遗传,经PCR验证绿色荧光蛋白基因转入成功。盆栽试验中,两种转化子均能成功定殖于西瓜幼苗根部,在定殖初期,尖镰孢菌西瓜专化型在根内的扩散速度快于哈茨木霉M3菌株。     

利用RAPD建立快速鉴定哈茨木霉的SCAR分子标记

在前期形态学分类及大量RAPD分析的基础上,选取在RAPD扩增45号哈茨木霉菌株获得的1条特异性片段,将其成功转化为1个稳定的SCAR标记.结果表明,该SCAR分子标记具有种的特异性,可将哈茨木霉属与其他木霉属分开.利用该标记对供试的45个木霉菌菌株进行PCR特异性扩增时,哈茨木霉菌菌株均能扩增出1条779 bp的DNA条带,不属于哈茨木霉的菌株则无扩增产物.     

西贡蕉枯萎病生防木霉菌株gz-2的鉴定及生物学特性研究

拮抗西贡蕉枯萎病菌的木霉菌株gz-2是一株具有生防潜力的拮抗菌,依据其形态特征和ITS序列将其鉴定为哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai).gz-2菌株的生物学特性测定结果表明,该菌株最适宜在马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基上生长;蔗糖、酵母膏分别为最佳碳氮源;菌丝最适生长温度范围为28～30 ℃;最适pH 5.0～6.0;不同光照条件对该菌产孢影响明显.对西贡蕉枯萎病的盆栽防治试验结果表明,gz-2菌株对西贡蕉枯萎病具有一定的防效,其中每隔7 d施1次gz-2固体菌剂处理的防治效果最好,在伤根接种60 d后,平均防效达到74.4 %.     

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。     

顶头孢霉原生质体制备、再生及带vgb基因的质粒DNA转化条件的研究

对头孢菌素C的工业生产菌种顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)原生质体形成和再生条件进行了研究。优化后的制备及再生条件为:在蛋白胨固体培养基上培养110~120 h的菌丝体,30℃条件下经1%蜗牛酶和1%纤维素酶混合液酶解3.5 h,原生质体得率最高可达2.377×107个/mL;在以KC(0.6 mol/L KCl+25mmol/L CaCl2.2H2O)为渗透压稳定剂的再生培养基上进行培养,再生率可达40%。用pMK4-LV质粒通过电击法对原生质体进行转化,成功得到了重组子,转化率约为10个转化子/μg质粒DNA。转化子的PCR鉴定结果表明,外源基因已转入顶头孢霉基因组。     

马铃薯疮痂病新致病种Streptomyces galilaeus CPS-2转化体系的建立

为建立马铃薯疮痂病新致病种Streptomyces galilaeus典型菌株CPS-2的转化体系,对该菌的原生质体制备和再生条件进行了筛选。结果表明,菌株CPS-2原生质体制备的最适条件为:TSB培养基一级培养24h,改良YEME培养基(含10%蔗糖和1.0%甘氨酸)二级培养60h,溶菌酶用量为3.0g/L,37℃酶解90 min,原生质体形成量可达4.4×109个/mL;在R2YE培养基上再生率可达22.71%。采用含25%PEG1000的Tbuffer介导转化质粒pIJ702,24h后覆盖含有硫链丝菌素的营养软琼脂,4d后可筛选到转化子,每微克质粒DNA可获得102~103个转化子。     

哈茨木霉T_2菌株耐药性的测定及其对几种病原菌的抑制作用研究

[目的]为提高木霉菌的生物防治效果。[方法]研究了哈茨木霉T2菌株对3种病原真菌(齐整小核菌、立枯丝核菌和香蕉枯萎病菌)的抑制作用,分析其对7种杀菌剂的耐药性,并探讨了哈茨木霉T2菌株与杀菌剂联用对立枯丝核菌和齐整小核菌的抑制作用。[结果]哈茨木霉T2菌株对病原真菌的抑制随处理时间的延长而增强。处理后120 h其对齐整小核菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌的抑制率最高,分别为63.10%、65.64%和33.84%。哈茨木霉T2菌株对多菌灵的耐药性最强,EC50为4 345.32 mg/L。在浓度为800 mg/L时多菌灵对哈茨木霉T2菌株的抑制率为13.73%,当浓度在50 mg/L以下时抑菌率几乎为0。哈茨木霉T2菌株对代森锰锌、露星较敏感。[结论]哈茨木霉T2菌株与甲霜灵联用,能明显抑制齐整小核菌、立枯丝核菌的生长。     

绿色木霉菌T23原生质体的制备和再生

试验研究了绿色木霉T23菌株原生质体制备及再生的适宜条件,并对原生质体的释放和再生过程进行了形态观察。结果表明:绿色木霉T23菌株原生质体制备的最佳条件:菌龄为24 h,酶浓度为15 mg/mL,酶解时间为3~4 h,酶解温度为30~35℃。观察到木霉菌以菌丝断裂方式释放原生质体,以2种方式进行再生。     

以G418抗性为选择标记的金龟子绿僵菌原生质体转化的研究

[目的]提高绿僵菌的生防效果。[方法]利用PEG方法,将含有G418抗性标记的质粒pSM334转化绿僵菌原生质体,并在高于绿僵菌敏感的G418浓度下筛选转化子。[结果]转化率达15~23个/μg质粒。将转化子在非选择压力下连续培养5代,其抗性稳定不变。稳定性试验表明,所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。[结论]该研究为提高绿僵菌的生防效果提供了依据。     

以吡啶硫胺素抗性基因为选择标记的红曲菌原生质体转化研究

[目的]以吡啶硫胺素抗性基因(Pyrithiamine Resistance Gene,ptrA)为选择标记基因,对红曲菌原生质体转化体系进行研究,以期为红曲菌基因功能的研究奠定基础。[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将含有吡啶硫胺素抗性基因(ptrA)的pPTRⅡ质粒转入橙红色红曲菌AS3.4384原生质体中,随机挑选5个转化子,通过PCR方法和Southern杂交对转化结果进行检测,验证pPTRII质粒是否整合到转化子染色体DNA中。[结果]pPTRⅡ质粒转入红曲菌AS3.4384原生质体中的转化率为20～24个/μg,PCR检测结果显示,基因组DNA中有吡啶硫胺素抗性基因的存在,Southern杂交分析发现,ptrA基因随机整合到了转化子的染色体上,该结果表明ptrA基因可用作红曲菌转化的选择标记。[结论]该研究是吡啶硫胺素抗性基因在红曲菌中的首次转化研究,试验结果为红曲菌的基因功能研究奠定了基础。     

木霉菌素产生菌的诱变育种

[目的]筛选高产木霉菌素菌株,提高木霉菌素产量。[方法]以从枸骨中分离到的产木霉菌素的内生真菌———哈茨木霉为出发菌株,进行紫外线二次复合诱变处理,将筛选出的突变菌株连续转接5代,测定其遗传稳定性。[结果]随着照射时间的延长,哈茨木霉的致死率增大,选取致死率为88.1%的紫外线照射45 s作为最适处理剂量进行诱变育种。经过2次诱变的菌株的产孢时间提前,长出的菌落更为致密。经过初筛和复筛,最终获得1株高产突变株UV-5-3,其产抗生素的水平最高,为164.75μg/m l,比初次诱变筛选获得的突变株UV-3-1提高了56.77%,是出发菌株的2.3倍。传代试验表明,突变株UV-5-3的高产性能遗传特性稳定。[结论]利用紫外线二次复合诱变处理哈茨木霉可以获得高产木霉菌素菌株。     

响应面法优化泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基

[目的]采用响应面法对泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基进行优化。[方法]利用Minitab统计软件,采用中心复合响应面设计对泰妙菌素生产菌株原生质体再生培养基的琼脂浓度和蔗糖浓度进行了优化。[结果]泰妙菌素生产菌株原生质体的再生培养基优化为马铃薯20.00%(浸提液)+葡萄糖2.00%+蔗糖2.70%+琼脂1.56%,p H=6.5。优化后的再生培养基的单菌落复苏率由0.7‰提高到3.5‰。[结论]该研究可为泰妙菌素的研发奠定基础。     

玉蕈原生质体制备条件研究

[目的]探索了玉蕈原生质体的制备与再生的适宜条件。[方法]采用斜面、平板培养基和液体培养基,研究了玉蕈菌丝体酶解时间(1~5 h)、酶解温度(25℃)和菌龄(4~7 d)以及渗稳剂种类(甘露醇、蔗糖、KCl、MgSO4)对玉蕈原生质体制备与再生的影响,优化了玉蕈原生质体制备与再生的条件。[结果]玉蕈原生质体制备与再生的适宜条件是:渗稳剂为0.6 mol/L MgSO4.7H2O,玉蕈菌丝体酶解时间2h,酶解温度25℃,菌龄5 d。在此条件下,玉蕈原生质体的产量最高,达16.7×106个/ml。[结论]该研究为利用原生质体技术进行玉蕈育种奠定了基础。     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

以G418为筛选标记的极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)原生质体转化体系的建立

[目的]建立极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的原生质体遗传转化体系。[方法]采用酶解法制备极细链格孢菌的原生质体,并通过PEG/CaCl2介导的化学方法将含有G418抗性标记的DNA转入极细链格孢菌原生质体。[结果]转化子生长表型及其基因组DNA的PCR检测表明抗性基因已成功整合到极细链格孢菌基因组中。该方法的转化率达3~4个转化子/μg转化DNA。所获得的转化子在无选择压力下连续培养3代,G418抗性仍能稳定遗传。[结论]成功建立了极细链格孢菌的遗传转化系统,为极细链格孢菌的基因功能研究奠定了基础。     

原生质体紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株

[目的]对酸性普鲁兰酶产生菌的原生质体制备条件及诱变育种进行研究。[方法]对盐球菌（Halococcus sp.）Z1的原生质体制备和再生条件进行了研究,并对其原生质体进行紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株。[结果]菌体经培养14 h后,在36℃、2.8 mg/ml溶菌酶作用下酶解1.5 h,其原生质体形成率和再生率分别为87.4%和19.4%。采用紫外线对原生质体进行诱变,筛选得到9株普鲁兰酶活性比出发菌株高的突变株,其中D9-08的酶活达6.37 U/ml,比诱变前提高了0.96倍,经10次传代遗传性稳定。[结论]利用原生质体紫外线诱变手段进行酸性普鲁兰酶产生菌的育种是一条可行并具有较好效果的途径。