家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSPH33对BmNPV诱导的免疫响应

[目的]了解BmSPH33基因在家蚕免疫应答方面的作用.[方法]BmSPH33基因进行生物信息学分析;利用GeneDoc与MEGA 5.0软件对BmSPH33与其它物种SPH33进行多序列比对和系统进化分析;利用半定量RT-PCR对其组织转录情况进行分析;qRT-PCR检测家蚕添食BmNPV后BmSPH33基因的表达情...     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。     

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serine protease gene, sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析.结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比, sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降.结果表明,丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达.家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础.     

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serineprotease gene,sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析。结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比,sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降。结果表明,丝氨酸蛋白酶(serineprotease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达。家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础。     

缢蛏丝氨酸蛋白酶基因的序列特征及其表达分析

含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶是一类新的丝氨酸蛋白酶家族,可能参与非特异性免疫防御功能。从缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库中筛选出一条丝氨酸蛋白酶同源EST序列,然后通过5’RACE扩增、测序,拼接得到全长为1 228 bp的cDNA序列,包括66 bp的5’非翻译区和160 bp的3’非翻译区,以及1 002 bp的开放阅读框。阅读框共编码333个氨基酸,含有17个氨基酸的信号肽序列,并含有发卡结构域(clip domain)和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域(Tryp_SPc domain)。在clip结构域中包含6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键,在Tryp_SPc结构域中包含His-Asp-Ser催化三联体(HDS)。该缢蛏丝氨酸蛋白酶基因被命名为ScSP。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,ScSP在缢蛏的外套膜、水管、鳃、斧足、性腺、肝胰腺6个组织中均有表达,尤其在肝胰腺中表达显著高于其他组织,其次为性腺组织,而水管,外套膜和鳃中表达量最低。缢蛏经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)诱导感染后4 h和8 h,肝胰腺中的ScSP基因表达量显著上调。缢蛏丝氨酸蛋白酶的序列特征与表达分析揭示了ScSP是含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶基因,参与了非特异性免疫防御,为进一步研究该基因的结构和功能奠定了基础。     

总状毛霉丝氨酸蛋白酶基因结构和功能的生物信息学分析

利用PCR和RACE(cDNA末端快速扩增)技术从总状毛霉中克隆获得1个丝氨酸蛋白酶新基因,利用生物信息学方法对该基因序列、编码的酶序列以及酶性质和结构进行预测。结果表明:该基因编码区序列长1 421bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码由429个氨基酸残基组成的多肽;对该多肽的组成和进化分析表明,其成熟肽属于蛋白酶K家族的胞外蛋白酶;通过同源建模结构分析表明,该酶没有二硫键,有152个氢键和29个盐键,酶的Glu190、Ala192和Asp215残基与一个Ca2+相结合,酶活性位点残基Asp44和Ser241溶剂可及表面积较大,分别达到0.211 42和3.309 32;该酶的底物结合区域中,S1和S4口袋结构明显,S2次之,S3最不明显,部分组成S1和S4口袋的氨基酸残基不保守,这可能使该酶具有独特的水解性。上述结果可为该蛋白酶基因的异源表达和结构与功能关系等方面的研究提供参考。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI37的克隆、 表达及微生物诱导分析

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。     

5龄家蚕乙酰胆碱酯酶基因的转录水平

乙酰胆碱酯酶(AChE)是有机磷和氨基甲酸酯类物质的作用靶酶.通过半定量PCR的方法测定家蚕4龄眠到上蔟期的2种ace基因的表达量,并测定该时期家蚕的AChE活性,以及5龄3d各组织中2种ace基因的表达量.结果表明,aceI基因在4龄眠到5龄第2天,第6天到第8天的转录表达最较多,第3天到第5天表达量相对较少;ace2基因在4龄眠期转录表达量多,进入5龄后,转录表达量减少且隔天转录表达量大致相同.在5龄中期和后期,AChE各具有1个峰值.5龄3d,acel基因在脂肪体、脑、卵巢中的转录表达量多,在其他组织中表达量较少,其中在血液中最少,ace2基因在脂肪体、精巢、卵巢中转录表达量多,在其他组织中表达量较少.     

家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）蛋白酶O基因Cathepsin O（BmCatO）,分析其mRNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长cDNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E. coil表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白,然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化,最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上,scaffold为nscaf2943,基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式,剪切体1开放阅读框（ORF）全长为1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量36 kD,等电点8.594;剪切体2 ORF全长为942 bp,编码313个氨基酸,预测蛋白分子量40 kD,等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成,剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似,均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明,无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类,且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟（Chilo suppressalis）组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞,剪切体1的表达水平明显高于剪切体2,但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶O原核表达系统,利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶O重组蛋白,并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA显示其效价高达到1﹕1 280 000。Western印迹结果表明,该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。     

蛇毒丝氨酸蛋白酶的研究进展

蛇毒丝氨酸蛋白酶(Snake Venome Serine Proteinases,SVSPs)是蛇毒中一类重要的蛋白水解酶,与凝血系统关系密切,具有重要的临床应用价值。笔者对SVSPs的种类与生物学功能、应用、纯化、分子生物学研究等方面进行了综述,同时也指出了目前存在的问题及今后的发展方向,以期为进一步的基础研究提供理论基础。     

广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因 克隆与序列分析

[目的]了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据.[方法]对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树.[结果]广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现.仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%.19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性.[结论]广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点.     

异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型多角体病毒感染性的影响

 将 Ac MNPV的 polh基因克隆到缺失 polh基因的 Bm NPV(API4)基因组中 ,得到被 Ac MNPV多角体蛋白包埋并可表达慈菇蛋白酶抑制剂的重组病毒 Bm NPV(OAc- API4)。发现它的芽生型病毒能感染家蚕细胞和经皮下注射感染家蚕幼虫 ,但包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆及表达

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其连接至pMD18-T载体上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列.利用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下.表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切,与目的片断连接,得到重组表达质粒pGEX/Bm75.将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL 21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57 kDa左右的特异蛋白质条带.对表达产物进行Westernblotting分析,结果表明,pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57 kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,融合蛋白得到了表达.     

家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp,其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kD,等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

RNA干涉家蚕细胞Ago蛋白家族基因的表达研究

分别构建RNAi(RNA interference,RNAi)载体干扰家蚕细胞BmN中Argonaute1(Ago1)和Argonaute2(Ago2)基因的表达。首先利用PFBDM和pBac[A3-EGFPafm]载体构建Ago1和Ago2基因的RNA干涉载体,通过转染家蚕细胞发现,Ago1和Ago2基因表达明显下降。并观察细胞形态发现,转染RNAi载体96h后,家蚕BmN细胞逐渐失去正常的梭形状态,体积变大,形态变圆。该研究为进一步研究家蚕中small RNA的产生及作用机制提供了较好的基础。     

接种BmNPV后抗性品种和非抗性品种家蚕组织中2种酶活性的比较研究

[目的]探讨抗性品种和非抗性品种家蚕接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后体内羧酸酯酶(Car E)和乙酰胆碱酯酶(Ach E)活性的变化规律。[方法]对抗性品种及其对照品种家蚕添食Bm NPV,测定并比较中肠和血液中羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性变化。[结果]家蚕接种Bm NPV后,抗性品种的中肠中羧酸酯酶活性上升,而对照品种羧酸酯酶活性先升高,然后从第3天开始活性降低。抗性品种前2 d中肠的乙酰胆碱酯酶活性降低,而对照品种与之相反。家蚕接种Bm NPV后,抗性品种在第2天血液羧酸酯酶活性有所升高,此后基本保持不变,而非抗性品种在第3天羧酸酯酶活性升高后下降;抗性品种血液乙酰胆碱酯酶活性升高,对照品种前2 d乙酰胆碱酯酶升高后降低。[结论]抗性品种在感染Bm NPV病毒后其中肠中羧酸酯酶活性高于未感染的抗性品种,表明抗性品种对感染病毒做出了有效应答和防御;而在感染病毒后抗性品种的中肠与血液中乙酰胆碱酯酶活性均变化相对较小。据此推测,抗性品种在感染病毒后仍保持了相对稳定的代谢过程。     

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提...     

家蚕5-羟色胺受体基因的克隆及表达分析

【目的】5-羟色胺（5-HT）在许多生理过程中扮演重要角色,克隆介导5-HT生理效应的家蚕5-HT受体及组织表达分析,为研究家蚕5-TH受体基因功能奠定基础。【方法】利用基因组数据及半定量real-time PCR技术,鉴定克隆4种家蚕5-HT受体基因; 应用生物信息学方法分析5-HT受体在物种间同源性并构建系统进化树; 利用半定量real-time PCR方法分析它们在幼虫和成虫不同组织的表达情况。【结果】根据预测基因序列,设计特异引物,克隆得到4种5-HT受体基因序列,分别命名为5-HT1ABm、5-HT1BBm、5-HT2Bm、5-HT7Bm（GenBank登录号KM236100-KM236103）,其开放阅读框分别为1 395、1 341、1 881和1 497 bp,可编码464、446、626和498氨基酸。4种5-HT受体属于典型的G蛋白偶联受体。选择已报道的昆虫及脊椎动物的5-HT受体氨基酸序列进行比对并系统发生树构建,结果显示家蚕4种5-HT受体间的氨基酸序列相似度仅为30.4%。5-HT1A、5-HT1B、5-HT2、5-HT7 4种受体在昆虫中的相似性分别为45.4%、61.4%、48.4%、54.1%。另外,家蚕5-HT受体与其他昆虫甚至脊椎动物有较高的同源性,跨膜区的保守性比非跨膜区高。不同物种间的同一家族5-HT受体的相似性高于同一物种内不同家族5-HT受体的相似性,家蚕5-HT受体的进化关系与烟草天蛾最近。半定量real-time PCR结果显示,5-HT1ABm、5-HT1BBm在幼虫所有组织中均有表达。5-HT2Bm仅在幼虫的头、腹部神经索、精巢表达。5-HT7Bm在幼虫头部、腹部神经索、中肠、脂肪体、精巢、卵巢表达。5-HT1ABm、5-HT1BBm、5-HT7Bm在成虫中除雌性头部以外的组织中均有表达,而5-HT7Bm在雄蛾的生殖系统中表达量明显高于其他组织。5-HT2Bm在成虫中不表达。【结论】鉴定和克隆的4种家蚕5-HT受体基因,在昆虫和脊椎动物中具有较高的保守性,与烟草天蛾同源关系最近,它们在幼虫和成虫的组织表达模式具有多样性。