基于牡丹EST信息的滇牡丹SSR标记开发

对NCBI(美国国立生物技术信息中心)中牡丹的ESTs(expressed sequence tags)的序列进行分析,结果表明:在所分析的2 204条序列中,仅324条分布有SSRs(simple sequence repeats),占全部ESTs序列的14.70%;SSR的出现频率为15.20%,共计335个,其中,二核苷酸重复比例84.18%,三核苷酸重复比例为15.22%,四和六核苷酸重复比例为0.30%。在此基础上,利用软件(serafer 1.3)设计了51对备选SSR引物,以6个滇牡丹不同花色类群DNA为模板对引物进行筛选,其中,10对引物有扩增产物;用这些引物进一步在10个类群50个DNA模板进行多态性测试,结果显示:上述10对SSR引物均有多态性,且同一类群内不同模板DNA间也存在多态性。本研究结果证明:基于牡丹EST信息建立SSR标记是一种有效而可行的方法,有助于滇牡丹遗传多样性分析及基因组学方面的研究。     

杨树EST-SSR标记的开发

利用来自美洲黑杨及欧美杨的20 023条EST序列,进行EST-SSR标记开发研究.首先对这些EST序列进行序列拼接,然后在非重复序列中发现由二核苷酸至五核苷酸组成的SSR重复序列.共在10 816个非重复序列中发现1 604个序列含有SSR,占总非重复序列的14.8%.在发现的1 918个SSR重复序列中,二核苷酸重复是最丰富的重复类型,占总类型的62.3%.设计合成48对SSR引物,利用6个不同的杨树品种对其进行验证.结果约90%的引物获得扩增产物,58%的引物在6个不同杨树品种中产生多态性分离.另外,还对重复序列的数量及重复类型进行了讨论.     

基于沙棘转录组序列开发EST-SSR分子标记

[目的]本研究通过对蒙古沙棘"向阳"品种的转录组序列进行SSR引物开发,为沙棘亲本分析、遗传多样性和遗传育种等研究提供支持。[方法]利用已测得的转录组序列进行分析和筛选,整理具有SSR位点的序列,进行引物设计,随机挑选179条引物进行验证。[结果]得到具有SSR位点的EST序列17 383条,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复基元分别占62.77%、21.82%和13.77%;二核苷酸重复基元类型以AT和AG为主,三核苷酸重复基元类型以AAG、ATC和ATA为主。9 291条序列设计出扩增EST-SSR位点的引物,随机合成的179对引物中,142对扩增成功,选取其中92个位点的扩增产物上机检测,40个SSR位点(43.48%)呈现多态。对扩增稳定且峰图清晰的17个多态位点的进一步分析,得到蒙古沙棘天然群体在各位点的观测杂合度(HO)为0.083 0.875,期望杂合度(HE)为0.180 0.750。[结论]本研究开发出的EST-SSR标记,为后期进行沙棘属植物遗传多样性分析、遗传图谱构建及分子育种等研究提供了重要支持。     

基于桤木属转录组测序的SSR分子标记的开发

[目的]基于转录组数据开发适用于桤木属树种的SSR标记,揭示其在转录组序列中的分布类型及特征,为桤木属树种分子标记辅助育种提供有利工具。[方法]利用Micro SAtellite(MISA)软件对所有转录组序列进行SSRs搜索,并对SSR位点的数量、分布特征进行统计分析。设计100对SSR引物,采用琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳分离检测方法对3种不同倍性桤木属植物(12份材料)进行遗传多样性检测,确定引物多态性及通用性。[结果]85 769条Unigenes序列中发现8 678个SSR位点,分布在8 298条Unigenes中发生频率为9.67%,转录组序列中平均每14.04 kb长度就有一个SSR位点分布。其中,二核苷酸重复类型数量最多,占65.87%。根据转录组Unigenes序列,利用Primer 3软件共设计出4 531对符合要求的引物,挑选出的100对SSR引物中,获得18对多态性高、稳定性好的SSR引物。[结论]本研究可扩增出多态性位点的引物重复单元以二、三核苷酸重复为主。基于桤木属转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的引物为桤木属遗传多样性分析、分子育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘提供了丰富的候选分子标记。     

柿EST-SSR引物的开发及筛选

为丰富柿树SSR引物来源,利用从NCBI下载的9 474条柿属EST序列开发柿EST-SSR引物,并用于分析7个柿品种的遗传多样性。EST序列经去除低质量及冗余片段后拼接成1 390条重叠序列和4 097条无重复序列。共搜索到601条EST序列中含有540个SSR。SSR出现频率为10.96%,其中以2核苷酸为主(61.06%)。利用检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物100对,对7个柿样品进行了PCR扩增,31对引物有扩增带,占设计引物的31%,其中14对引物有多态性,占可扩增引物的45.2%。同时发现引物68是临潼板柿的特异引物。引物68的P68-115、P68-160和P68-210处为临潼板柿的3个特异性标记位点,而引物28的P28-225是麻城秋艳的特异性标记位点。     

云南金花茶转录组SSR的分布及其序列特征

分析云南金花茶转录组中的SSR位点信息及其序列分布特征,为SSR引物的大量开发奠定前期基础。利用MISA软件分析了云南金花茶转录组数据155 011条Unigenes的SSR位点信息,在云南金花茶转录组中共检测到30 435个SSR位点,出现频率为19.63%,平均3.46 kb就出现1个SSR位点。而重复基元类型从二核苷酸到六核苷酸均有出现,其中二核苷酸重复基元为主要类型,占SSR总数的71.44%;其次是三核苷酸,占SSR总数的25.48%;四核苷酸到六核苷酸仅占3.08%。AG/TC与CT/GA是二核苷酸的优势重复基元,分别占总基元的26.75%与25.17%;CTT/GAA与AGA/TCT是三核苷酸的优势重复基元,分别占总数的2.64%与2.23%。根据云南金花茶转录组测序结果,云南金花茶转录组的SSR位点出现的频率较高,具有丰富的基元类型,并且有较高的重复次数,具有较高的多态性潜力。随机选出50对设计的SSR引物用于检测,其中有14对引物能扩增出清晰且单一的谱带。对云南金花茶转录组数据中SSR位点信息进行分析,可为其SSR引物的设计与筛选、SSR遗传多样性分析以及种质资源的保护提供理论依据。     

白皮松EST-SSR序列分布特征及引物开发

为解决白皮松分子标记资源相对匮乏的问题,对其针叶转录组测序结果进行检测分析及引物开发,结果在针叶转录组数据中共检测到精确型SSR位点3 268个以及复合型SSR位点104个,序列长度为10～27 bp的短序列(2 954,93.36%)占主导地位;SSR重复单元的重复次数在4～30次之间,重复次数为9次的重复单元数量最多,所占比例最大(684,20.93%);在所有142个重复单元中,A/T所占比例最大(1 508,46.14%),其次为AT/CA(280,8.57%)和TA/TC(245,7.50%);从所设计的1 151对引物中,随机选择60对EST-SSR引物,对来自不同地区的50株白皮松优树进行PCR扩增,有28对引物能扩增出清晰的条带,有效扩增率为46.67%,其中多态性引物2对,引物多态率为7.14%,多态性信息含量PIC分别为0.375、0.305。为了检验引物的多态性,又选择了7对已发表的对白皮松基因型具有多态性的SSR引物进行验证分析,结果发现,这7对引物均能扩增出清晰的条带,但对50株白皮松优树均无多态性,也侧面说明了白皮松基因序列的相对保守性。该研究结果为白皮松种质资源评价、分子标记辅助育种等方面的研究提供了参考。     

基于转录组序列的楠木SSR分子标记开发

【目的】通过对楠木转录组数据的分析,开发楠木SSR分子标记技术,为楠木遗传多样性分析和资源保护提供保障。【方法】将楠木高通量转录组测序获得的67 331条Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析,并结合引物验证,初步证明其可行性。【结果】通过软件分析,共获得9 405个SSR位点,出现频率为13.97%,涉及序列数量为6 667条,发生频率为9.90%。SSR序列中包括166种重复基元类型,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,SSR位点数分别为3 890(41.36%),2 885(30.68%),2 489(26.46%)。SSR位点重复次数差别较大,其中重复10次比例最高,SSR位点数为1 621(17.24%),其次是5次(1 549,16.47%)和6次(1 495,15.90%)。主导重复基元类型为A/T(40.67%),AG/CT(27.59%),AAG/CTT(11.29%)。运用多态性分析的方式初步验证了SSR位点在楠木标记中的可行性。同时,利用Primer 3.0进行引物设计,随机筛选18对进行验证,9对引物可以扩增出预期大小的条带。【结论】通过对楠木高通量转录组序列的SSR信息的研究,获得6 667条SSR序列,主导重复类型为A/T,AG/CT和AAG/CTT。同时随机挑选18对引物对SSR分子标记方法进行验证。本文对楠木SSR标记的研究将有助于楠木基因挖掘、分子标记育种和资源保护。     

杜仲基因组微卫星特征及SSR标记开发

为全面解读杜仲的遗传背景,本研究在基因组测序(数据未公布)的基础上,通过MISA软件搜索杜仲基因组(26 947/854 758 160 bp)中的完整型(1～7核苷酸重复)及复合型SSR序列,共查找出25 694个Scaffolds含有488592个SSR位点,占总Scaffolds的95.3％.从SSR位点分布密度上讲,平均每1 749 bp出现1个微卫星,其中单核苷酸重复单元的SSR含量最多,约占总数的54.34％,其次为二核苷酸(20.47％),而复合模式、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和七核苷酸重复分别占20.29％、23.89％、0.77％、0.13％、0.10％和0.01％,并发现SSR中均以含A、T的重复类型占主导地位.根据SSR位点设计并合成引物290对,162对SSR引物扩增出清晰的目的条带,其中16对引物多态性高、稳定性好,在8份杜仲资源中共检测到84个等位基因,平均每个SSR位点检测到5.25个等位基因.本研究对于进一步利用SSR分子标记分析杜仲遗传多样性、遗传图谱构建、杜仲雌雄株早期鉴定等具有较高的应用价值.     

基于核桃参考基因组的SSR位点鉴定分析和单态性标记开发

目的 为了阐明核桃（Juglans regia L.）（2n=2x=32）全基因组不同染色体上SSR位点数量及其分布特征,开发并验证单态性SSR引物。 方法 基于核桃品种‘中牧查一’的高质量参考基因组序列图谱,使用MISA软件筛选并分析SSR位点,利用Primer 3.0进行引物设计,通过电子PCR进行引物多态性分析,筛选并合成单态性SSR引物并通过真实PCR实验验证其有效性。 结果 （1）在全基因组16条染色体上鉴定得到了共计357 629 个SSR位点,分布密度为662.28 SSRs·Mb−1,其中,10～30 bp长度的短序列占95.00%以上,优势重复单元以A/T碱基为主;不同染色体上SSR位点数量差异较大,其中,Chr1染色体上SSR位点数量最多,Chr16染色体上最少,SSR重复单元的数量及种类与染色体长度呈极显著正相关,进一步统计分析获得的644 种稀有SSR单元中六核苷酸重复基元占多数;（2）基于不同染色体上SSR重复单元的类型和数量构建分布矩阵,聚类分析发现,以遗传距离0.075为阈值可将所有染色体分为4组,其中,第4组中成员最多（11条）,而第1组中仅有Chr10染色体,总体看,Chr10染色体自成一个主枝,显示其可能经历了较为保守的进化过程;（3）利用SSR 位点侧翼的保守序列设计出SSR引物303 009对,通过电子PCR筛选并随机合成了32对单态性引物进行验证,其中,30对（93.75%）在6 个核桃品种中扩增出了清晰的目标产物,28对（87.50%）的PCR扩增结果与电子PCR评估结果一致。 结论 本研究鉴定了‘中牧查一’核桃参考基因组不同染色体序列中的SSR位点,发现其数量和重复类型变化较大,且与染色体长度呈极显著正相关,单碱基重复的SSR是最常见的类型。建立了电子PCR与传统方法联用的引物开发流程,同时验证了其有效性,为核桃SSR引物的个性化快速开发提供了有效策略。筛选获得的28对单态性引物可为分子辅助育种中杂交子代“私生检测”等研究提供科学借鉴与参考。     

Analysis of SSR loci and development of SSR primers in Eucalyptus

In this study,28,691 genome sequences and16,566 expressed sequence tags(ESTs) of Eucalyptus were derived from the Gen Bank database.A total of 2292 SSR loci were sought out from 1785 effective sequences.Through analyses of SSR loci information,the SSR motif length was negatively correlated with the abundance of the SSRs.In the EST sequences of Eucalyptus,triplet repeat motifs were the most abundant,and dinucleotide repeats motifs had the highest frequencies.Subsequently,395 pairs of primers were designed based on the SSR loci.Using optimized SSR-PCR conditions,340 pairs of primers were successfully screened,with a success rate of 86.1%.By construction of a maximum likelihood phylogenetic tree of six eucalypt species,represented by five species of the genus Eucalyptus and one of the genus Corymbia,the genetic relationships of Eucalyptus urophylla and E.camaldulensis suggested by this tree was found to differ from that suggested by traditional morphological taxonomy.The results provide insights for evaluating geneticdiversity of Eucalyptus and analysis of Eucalyptus phylogenetics using SSR markers.     

磁珠富集法快速制备油茶基因组微卫星标记

利用磁珠富集高效微卫星分离法,设计生物素标记的寡核苷酸（AG）15与（AC）15作为探针,快速分离油茶微卫星序列并建立其SSR分子标记体系。从获得的52份具微卫星序列的克隆测序结果中,成功开发40对油茶SSR引物,序列开发引物成功率在76.9%;对扩增结果进行比较分析后,共得到14对具有清晰扩增条带的SSR引物,占总引物的35%;进一步利用18个油茶无性系开展引物多态性检测,显示6对SSR引物具良好的多态性。研究结果可为油茶遗传学研究提供新的分子标记工具,同时为山茶属其他重要经济树种的相关研究提供很好的借鉴。     

磁珠富集法开发毛竹SSR标记引物

用磁珠富集法筛选毛竹基因组DNA的SSR分子标记,利用磁珠法对毛竹基因组DNA的AFLP片段进行了富集,分别构建了富含GT、AG、CCA重复基元的富集文库,利用克隆PCR法对文库进行筛选,检测菌落数分别为1080、620、630个,阳性菌落中含目的重复的序列分别为137、73、41个,富集效率分别为12.7％、11.8...     

Analysis of EST-SSRs in silver birch(Betula pendula Roth.)

Simple sequence repeats(SSRs) defined as sequence repeat units between 1 and 6 bp occur abundantly in both coding and non-coding regions in eukaryotic genomes and these repeats can affect gene expression. In this study, ESTs(expressed sequence tags) of Betula pendula(silver birch) were analyzed for in silico mining of ESTSSRs, protein annotation, open reading frames(ORFs),designing primers, and identifying codon repetitions. In B.pendula, the frequency of ESTs containing SSRs was 7.8 %with an average of 1SSR/4. 78 kb of EST sequences. A total of 188 SSRs was identified by using MISA software and dinucleotide SSR motifs(65.9 %) were found to be the most abundant type of repeat motif followed by tri-(27.1 %),tetra-(4.8 %), and penta-(2.2 %) motifs. Based on ORF analysis, 175 of 178 sequences were predicted as ORFs and the most frequent SSRs were detected in 50 UTR(58.43 %),followed by in ORF(31.46 %) and in 30UTR(8.43 %). 102 of 178 ESTs were annotated as ribosomal protein, transport protein, membrane protein, carrier protein, binding protein,and transferase protein. For a total of 102 SSRs(57.3 %)with significant matches, a set of 102 primers(100 %) with forward and reverse strands was designed by using Primer 3 software. Serine(Ser, 19.6 %) was predominant in putative encoded amino acids and most of amino acids showed nonpolar(35.3 %) nature. Our data provide resources for B.pendula and can be useful for in silico comparative analyses of Betulaceae species, including SSR mining.     

小菊花色芽变品种的AFLP分析

采用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技术对小菊花色芽变品种与原始品种的DNA进行差异性分析,旨在建立芽变品系形态学以外的分子水平鉴定技术。在引用13对引物中,每对引物平均扩增出13.5条多态性带,分子量在110～800bp之间。3对引物组合(第8对E-ACG/M-CAT、第10对E-AGG/M-CTC、第11对E-AGG/M-CTG)产生5条清晰特异性条带可以将二者区分,这些特异性片段可能包含引起花色芽变的基因序列,经计算,二者遗传相似系数为0.986,遗传物质多态性为2.81%。     

Analysis of SSR loci and development of SSR primers in <Emphasis Type="Italic">Eucalyptus</Emphasis>

In this study, 28,691 genome sequences and 16,566 expressed sequence tags (ESTs) of Eucalyptus were derived from the GenBank database. A total of 2292 SSR loci were sought out from 1785 effective sequences. Through analyses of SSR loci information, the SSR motif length was negatively correlated with the abundance of the SSRs. In the EST sequences of Eucalyptus, triplet repeat motifs were the most abundant, and dinucleotide repeats motifs had the highest frequencies. Subsequently, 395 pairs of primers were designed based on the SSR loci. Using optimized SSR-PCR conditions, 340 pairs of primers were successfully screened, with a success rate of 86.1%. By construction of a maximum likelihood phylogenetic tree of six eucalypt species, represented by five species of the genus Eucalyptus and one of the genus Corymbia, the genetic relationships of Eucalyptus urophylla and E. camaldulensis suggested by this tree was found to differ from that suggested by traditional morphological taxonomy. The results provide insights for evaluating genetic diversity of Eucalyptus and analysis of Eucalyptus phylogenetics using SSR markers.     

基于松属不同树种EST序列的马尾松SSR引物开发

利用松属5个树种的EST序列,分别树种查找SSR位点,采用Primer3．0软件进行引物设计。设计的5个树种的EST-SSR引物中：所占比例最高的均为三核苷酸重复,其次是六核苷酸重复,两者之和都达到了64％以上;四核苷酸重复所占比例均为最低。从设计的引物中分别不同树种各选取20对进行引物合成和通用性检测以及马尾松群体检测,结果表明：松属5个树种的EST序列开发的马尾松SSR引物,其在马尾松中的扩增成功率为60％-80％;最高的是辐射松,最低的是海岸松,平均为72％。通用性最好的为辐射松,属内的通用性为94％;属间和科间通用性也分别达到75％和44％。不同树种序列来源的EST-SSR引物,其扩增成功率在10％-30％;最高的是北美短叶松,其次是辐射松,最低的是扭叶松和火炬松;平均为17％。