单克隆抗体检测栗疫菌dsRNA的研究初报

 本文利用dsRNA特异性单克隆抗体,采用双抗体夹芯ELISA法,检测了栗疫菌中的dsRNA.结果表明,该法不仅能从栗疫菌低毒力菌株的总核酸粗提液中检测到dsRNA而不受其它核酸的干扰,而且比电泳法简便迅速,在大量筛选含dsRNA的栗疫菌低毒力菌株中具有很大的实用价值。     

栗疫病菌的培养性状、毒力与dsRNA的关系

 根据菌落的培养性状将中国东部12个省(市)的429个栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌株划分为5种培养类型。其中Ⅰ型为桔黄色菌落的野生型正常菌株,占总菌株数的89.3%;Ⅱ~Ⅳ型为培养性状不正常菌株,共有46株,菌落有黄褐色、白色和深褐色等类型。供试菌株间存在明显的毒力分化,可分为强中弱三种类型。培养性状正常的菌株毒力普遍较强,极少菌株检测到dsRNA;培养性状不正常的菌株毒力一般较低,在菌落白色的菌株中都检测到dsRNA。在所测试的70个菌株中含dsRNA的菌株有38个,其中32个属于弱毒力类型,其他6个属中毒力类型;分布于除河南、湖南和广东以外的其他9个省(市)。     

栗疫病菌菌株的毒性联合与毒性分离现象的初步研究

 对来自3个中国板栗居群的共18个栗疫病菌株进行单株及混合菌株的毒力评价,结果表明各单株毒力差异显著,混合菌株存在毒性联合与毒性分离现象。同一种群的组合中有64.4%为毒性联合,不同种群的组合其毒性分离率高达88%,同一种群组合的毒性联合强度比不同种群组合的毒性联合强度大,而不同种群组合的毒性分离强度比同一种群组合的毒性分离强度大。大多数组合的毒性联合或毒性分离的性状表达稳定。     

低毒病毒CHV1-CN280生防潜力的初步研究

前期研究表明,分离自中国的低毒病毒CHV1-CN280与其它多数低毒病毒相比具有更高的水平传播能力。本研究中,我们对CHV1-CN280的田间定殖能力及其它生防性状进行了评估。与其它两个模式低毒病毒相比,CHV1-CN280对栗疫菌Cryphonectria parasitica的毒力显著弱于典型的烈性低毒病毒CHV1-EP713,而更接近于典型的温和低毒病毒CHV1-Euro7。强致病性的栗疫菌感染CHV1-CN280后,成为典型的低毒菌株,不再对板栗植株造成严重危害,但是与感染典型烈性低毒病毒CHV1-EP713的菌株相比,寄主真菌在板栗枝条上仍保持了一定的定殖能力,其菌丝生长速率和分生孢子产量较高。初步的田间试验表明,在人工接种两年后,CHV1-CN280在田间成功定殖,并已扩散到田间自然存在的、与人为释放的低毒菌株不亲和的其它营养体亲合群的栗疫菌菌株中。结果表明,低毒病毒CHV1-CN280对栗疫病具有非常好的生物防治潜力。     

板栗疫病发生规律及综合防治

栗疫病的防治应从栽培管理入手，增强树势，提高树体抗病性，以营林防治为基础；以生物颉颃剂治疗，修复病斑为主导，以化学防治为辅助手段，引种严格检疫，防止栗疫病扩大与蔓延等综合防治措施，能有效地控制栗疫病的发生。通过3年的综合防治试验，病情指数下降率达70．2％－84．6％，树干病斑愈合率达100％，在防治的当年实现了增产增收。     

球孢白僵菌经不同基质继代移殖后对松墨天牛毒力的变化

以筛选得到的分离自松墨天牛的球孢白僵菌高毒力菌株B5、Bxs、低毒力菌株B11和分离自松毛虫的球孢白僵菌低毒力菌株BZ为出发菌株,记为B0。通过连续接种松墨天牛幼虫分别获得H1、H2、H3、H4;连续在PPDA培养基上继代移殖,分别获得R1、R2、R3和R4,对各原始菌株与继代移殖菌株分别进行毒力测定。结果表明：高毒力菌株B5、Bxs与低毒力菌株B11、BZ在PPDA培养基上继代移殖,各菌株毒力均逐代下降,原始菌株、各继代移殖菌株彼此间的LT50差异显著。分离自松墨天牛的B5、Bxs、B11菌株通过松墨天牛幼虫继代移殖后毒力逐代提高,逐代之间的LT50差异显著;但来源于松毛虫的Bz菌株逐代之间的LT50差异不显著,这可能跟球孢白僵菌对寄主的专化性有关。     

栗疫病菌侵染板栗枝条的显微观察

栗疫病是一种严重危害栗属植物的病害。为了明确栗疫病菌侵染板栗枝条的过程及侵染的关键时间点,本研究利用病理组织切片技术、显微镜和扫描电镜技术对栗疫病菌侵染板栗枝条的过程进行了观察。结果表明:接种栗疫病菌后0～5 h,菌丝先降解枝条表皮,进行横向营养生长的同时沿着伤口纵向侵染,为进入皮层做准备;接种后6 h病菌开始在表皮定殖,并侵入皮层;接种后9 h在皮层可观察到侵染性菌丝沿着细胞间隙向相邻细胞延伸;接种后12 h栗疫病菌侵入韧皮部,在皮层的侵染面积扩大。随着侵染程度加深,皮层、韧皮部等处细胞被菌丝降解,最终在形成层附近聚集。接菌后9 h为栗疫病菌侵染板栗枝条的关键时间点。     

10种杀菌剂对板栗疫病菌的抑制作用

为了筛选防治板栗疫病的高效、低毒、低残留杀菌剂,采用菌丝生长速率法测定了10种杀菌剂对栗疫病菌菌丝生长的抑制效果。结果表明,苯醚甲环唑+丙环唑、苯醚甲环唑、咯菌腈、咪鲜胺和多氧霉素对栗疫病菌具有很强的抑制作用,EC₅₀在0.014 8～8.752μg/mL之间,为生产上有效地防治板栗疫病提供了依据。     

河南小麦白粉病秋季菌源毒性结构的初步分析

1990年河南省中部秋播麦田小麦白粉病普遍发生。采集64个菌株,测其对32个已知抗白粉病基因品种(系)和推广品种毒力频卒结果,秋季菌源对Pm1、Pm3a、Pm3b、Pm3c和Pm5的毒力频率较高;对Pm2x和Pm2+6以及肯贵阿一号的频率较低;对Pm2和Pm8的频率已经上升;对许多推广品种毒力频率较高。说明目前存在着大面积感病寄主,生产上应做好化学防治准备。此外秋季菌源中存有极复杂的生理专化现象,其中对鉴别寄主低毒性的小种占优势。     

几株高效苏云金杆菌菌株对玉米螟、棉铃虫、粘虫和黄地老虎的毒力测定

本文以玉米螟、棉铃虫、粘虫和黄地老虎为供试昆虫，对筛选出的７株高效苏云金杆菌菌株的孢晶制剂进行了毒力测定。以ＬＣ５０为衡量各菌株的毒效指标，属血清型Ｈ６的“Ｇ０２”菌株对上述４种供试昆虫的毒力最高，属血清型Ｈ３ａ３ｂ的“８０－１”菌株对棉铃虫和粘虫的毒力也高于“ＨＤ－１”菌株。这一研究结果为今后生产高效的苏云金杆菌制剂及生产菌株的轮换提供了后备菌株     

几株高效苏云金杆菌菌株对玉米螟,棉铃虫,粘虫和黄地老虎的毒力…

本文以玉米螟、棉铃虫、粘虫和黄地老虎为供试昆虫，对筛选出的７株高效苏云金杆菌菌株的孢晶制剂进行了毒力测定。以ＬＣ５０为衡量各菌株的毒效指标，属血清型Ｈ６的“Ｇ０２”菌株对上述４种供试昆虫的毒力最高，属血清型Ｈ３ａ３ｂ的“８０－１”菌株对棉铃虫和粘虫的毒力也高于“ＨＤ－１”菌株。这一研究结果为今后高效的苏云金杆菌制剂及生产菌株的轮换提供了后备菌株。     

我国小麦秆锈菌的毒性分析

 用40个近等基因系(near-isogenic line)对我国小麦秆锈菌的毒性进行了测定。按照美国禾谷类锈病室(Cereal Rust Laboratory)规定的密码(Code)命名的系统,小种HKR是最普通的毒力组合;占全部70个标样、127份菌株的33.1%。第二个优势小种是RKR,占全部菌株的24.4%。没有发现对Sr9e,11、38,Gt和Tmp有毒力的菌株。对Sr13,22,24,26,29,30,37的毒力频率较低、均在10%以下。毒力频率值在90%以上者(接近90%)的有Sr6,7a、7b、8a、9a、9d、9f、9g、10、12、14、15、16、18、20、28、34、36、dp-2和H。我国小麦秆锈菌无论是毒力组合或毒力频率都与北美的有很大区别。     

我国小麦秆锈菌的毒性分析

用40个近等基因系(near-isogenic line)对我国小麦秆锈菌的毒性进行了测定。按照美国禾谷类锈病室(Cereal Rust Laboratory)规定的密码(Code)命名的系统,小种HKR是最普通的毒力组合;占全部70个标样、127份菌株的33.1%。第二个优势小种是RKR,占全部菌株的24.4%。没有发现对Sr9e,11、38,Gt和Tmp有毒力的菌株。对Sr13,22,24,26,29,30,37的毒力频率较低、均在10%以下。毒力频率值在90%以上者(接近90%)的有Sr6,7a、7b、8a、9a、9d、9f、9g、10、12、14、15、16、18、20、28、34、36、dp-2和H。我国小麦秆锈菌无论是毒力组合或毒力频率都与北美的有很大区别。     

板栗病毒的发现

板栗是世界上分布很广泛的一种重要的园艺作物,经济栽培价值很高。世界上的板栗大致有4个大的经济种类,分别是中国板栗（Castanea mollissima Blume）、美洲板栗、欧洲板栗和日本板栗。栗疫病是世界上最著名的森林病害之一,19世纪末20世纪初,该病使美洲栗遭到全面灭种的威胁,成为植物病害摧毁自然种的唯一例子。     

几丁质酶基因在球孢白僵菌中的超表达提高其对马尾松毛虫的毒力

几丁质酶在虫生真菌穿透寄主体壁的过程中起一定作用,但其与真菌毒力的关系尚不清楚。本研究通过几丁质酶基因在球孢白僵菌Beauveria bassiana中的超表达以及超表达菌株的毒力变化研究了该基因与毒力的关系。将几丁质酶基因Bbchit1通过芽生孢子转入野生型球孢白僵菌中,获得多拷贝的转化子;转化菌株在胶体几丁质诱导培养基中酶活最大值高于出发株4.2倍,表明该几丁质酶基因在转化菌株中得到超表达。毒力测定发现转化子对马尾松毛虫Dendrolimus punctatus的致死中浓度比出发株降低84.5%,在2.5×107孢子/ml浓度下的致死中量减少84.5%,致死中时缩短0.7d,因此毒力大大提高。第2~9d感病死虫数与转化子第1~8d酶活呈极显著正相关（P〈0.01）,而与出发株不相关（P〉0.05）。这些证据表明,几丁质酶与毒力的关系是复杂的,在分泌达到一定阈值后与毒力才有明显的相关关系。     

苏云金杆菌高毒力菌株4．0718的快速选育

从湖南省不同生态区域的旱作地，果园和稻园采集的858份土样中，分离筛选出苏云金杆菌30株。选取一株具典型苏云金杆菌菌落特征和较高杀虫毒力的菌株701^2c为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变，显微涂片染色镜检，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量及芽孢与伴孢晶体的比例与杀虫菌株4．0718。该突变株杀虫毒力与原始菌株相比提高了7．5倍，在6、12和24h内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株的高效速效杀虫毒力经连续10代培养能稳定遗传。     

绿僵菌不同转化子毒力差异与胞外酶的相关性分析

为了明确含有cry8E基因的绿僵菌Metarhizium anisopliae不同转化子存在毒力差异的原因,揭示胞外酶与毒力之间的关系,本研究测定了6株含cry8E基因绿僵菌阳性转化子的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、几丁质酶和磷脂酶活性及其对暗黑鳃金龟幼虫Holotrichia parallela毒力,并分析了各个酶活指标与菌株毒力之间的相关性。生测结果表明,不同转化子间毒力差异较大,LT50的变化范围为14.48~21.26 d,校正累计死亡率变化范围为64.50%~92.86%。酶活测定结果表明,不同菌株之间活力差异较大,且不同酶的活力变化规律不一致。将不同转化子的酶活分别与校正累积死亡率和LT50值进行一元回归分析,发现各转化菌株酸性蛋白酶和几丁质酶与毒力相关显著。为了进一步确定酸性蛋白酶和几丁质酶对毒力的综合影响,将不同转化子的酶活与校正累积死亡率、LT50进行二元回归分析,发现仅有几丁质酶活性与菌株毒力相关性显著。因此,推测不同转化子对寄主毒力存在差异主要是由于菌株间几丁质酶活性不同,几丁质酶可以作为大量转化子初步筛选的参考性指标,但是不能完全替代。     

栗疫病菌不同毒力菌株生物学特性的研究

 对不同毒力、含或不含dsRNA的菌株的生物学特性进行了研究。含dsRNA的弱毒力菌株的分生孢子后代,可分化出白色和桔黄色两种菌落类型,菌落白色的单孢菌株,可继续分化出白色和桔黄色两种类型的后代,桔黄色的单孢菌株保持稳定,不再发生分化。不含dsRNA的菌株,未见培养性状发生分化。对含dsRNA的弱毒力菌株的第2代两种类型的单孢菌株进行了毒力测定和dsRNA检测,桔黄色的单孢菌株的毒力水平达到或接近强毒力菌株的水平,不含dsRNA;而白色的单孢菌株的毒力很弱,且都含有dsRNA。对不同毒力菌株分生孢子的萌发率进行了比较,结果表明,孵育12h后,即有部分菌株的分生孢子开始萌发,强毒力菌株孢子的萌发最早,含dsRNA的弱毒力菌株的孢子萌发较迟;孵育24h后,各菌株孢子的萌发率均达到90%以上,差异已不太明显,但芽管的分枝程度有较大差异,强毒力菌株的芽管(菌丝)大量分枝,初步形成菌丝丛,而弱毒力菌株,不论是否含有dsRNA,芽管的分枝程度均较低。     

球孢白僵菌脂肪酸、酯酶、脂肪酶及其与毒力的关系

研究12株球孢白僵菌脂肪酸、酯酶和脂肪酶的产生水平及菌株对马尾松毛虫毒力间的关系。结果表明：酯酶产生水平（E）、脂肪酶产生水平（L）及豆蔻酸百分含量（X）等与白僵菌菌株对马尾松毛虫的毒力（LT50）间存在一定的相关性，其相关方程分别为：LT50=2．0931/（lgE-5．1165）＋0．4091；LT50=-6．68L^2＋31．9886L；LT50=13．5192-8．7042X。     

对小猿叶甲高毒力烟曲霉菌株的选育技术

大猿叶虫（Colaphellus bowringi Baly）和小猿叶虫（Phaedon brassicae Baly）均是南方十字花科蔬菜主要害虫之一,宁波地区8—11月,其在十字花科蔬菜上为害比菜青虫（Pieris rapae）、小菜蛾（Plutella xylostella）严重。目前十字花科蔬菜上大量应用的生物农药Bt、阿维菌素对菜青虫、小菜蛾具较好防治效果,但对大、小猿叶虫基本无效。大、小猿叶虫的发生规律同菜青虫、小菜蛾不一样,幼虫、成虫常常隐蔽在蔬菜的根部、菜心和土中,菜农只能依靠多次喷化学农药如毒死蜱＋敌敌畏控制它们的危害。我们从田间筛选到女贞潜叶甲生曲霉菌株,经初步鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus vat．fumigatus）（暂称叶甲生烟曲霉）。室内试验后发现,该菌株培养液能使大、小猿叶虫幼虫、成虫,女贞潜叶甲（Argapistes tsekooni）幼虫、菜青虫幼虫和夜蛾的幼虫发病死亡。通过化学、物理诱变选育对害虫的高毒力菌株已有报道。我们利用物理诱变和化学诱变方法选育对大、小猿叶虫有高毒力的烟曲霉菌株。现将结果报道如下。