白桦雄花序发育初期蛋白质的双向电泳图谱分析

对发育初期2个时期的白桦雄花序进行的蛋白质双向电泳(two-dimemional electrophoresis，2-DE)研究结果表明，2个时期的2-DE图谱，有275个蛋白点在表达上有明显的质和量的变化。其中：162个蛋白点在5月31日雄花序2-DE图谱中的表达量均高于5月28日，110个蛋白点的表达量低于5月28日；2个蛋白点为5月28日雄花序2-DE图谱所特有；1个蛋白点为5月31日雄花序2-DE图谱所特有。这些结果为进一步获得与雄花序发育时期的相关蛋白，进而得到相关的特异基因，在分子水平上揭示白桦雄花序发育机理奠定重要基础。     

两个家蚕CPFL表皮蛋白基因的鉴定与表达分析

昆虫CPFL表皮蛋白是一类重要的结构蛋白。本研究通过生物信息学分析从家蚕基因组中鉴定出2个CPFL基因,命名为BmHCP1和BmHCP2。氨基酸序列分析发现,2个蛋白在羧基末端均具有CPFL表皮蛋白典型的保守结构序列YGW以及重复序列AAH、AAPA、AAPV。进化树分析显示,2个蛋白与鳞翅目昆虫艺神袖蝶(Heliconius erato)和柑橘凤蝶(Papilio xuthus)具有较高同源性。荧光定量PCR分析显示,BmHCP1和BmHCP2存在组织、时相特异性表达,幼虫期在头部、中肠、表皮等组织中表达量较高;蛹期除翅原基、血淋巴、触角和足等组织外均有较高表达量;成虫期在足、触角、翅原基、表皮等组织中表达量较高;蛹期在大多数组织的表达量明显高于幼虫期和成虫期。研究结果为进一步探明家蚕表皮蛋白基因的功能奠定了基础。     

蜕皮前后家蚕幼虫血淋巴的蛋白质组学分析

 【目的】对家蚕幼虫血淋巴在蜕皮前后的蛋白质变化进行研究,发现参与蜕皮过程的蛋白质,为深入研究家蚕幼虫的蜕皮过程提供新的思路,也为研究其它昆虫的蜕皮过程提供启示。【方法】应用以双向电泳（2-DE）进行蛋白质分离、以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行蛋白质鉴定的蛋白质组学方法对家蚕幼虫血淋巴在蜕皮前后的蛋白质变化进行研究。【结果】经过蜕皮过程后,家蚕幼虫血淋巴中蛋白质的数量、种类和部分蛋白质的表达量发生了明显的变化：4眠蚕血淋巴中有10个明显的特异蛋白点,5龄起蚕血淋巴中2个明显的特异蛋白点,还有2个蛋白点的表达量发生了明显的上调或下调。经过质谱鉴定,以上14个蛋白点中 有9个具有可信结果,其中4种蛋白被过去的试验证明与蜕皮过程有关,其它5种蛋白质是新发现的与蜕皮过程有关的蛋白质。【结论】化学感应蛋白9、储存蛋白2、抗胰蛋白酶原、酚氧化酶原亚基1和亲环蛋白A、KIF27类蛋白、天蚕素原、副肌球蛋白、神经原钙结合蛋白以及另外5种未被鉴定的蛋白质可能参与了家蚕幼虫的蜕皮过程。     

家蚕幼虫期和蛹期马氏管差异蛋白质组学分析

【目的】深入了解家蚕幼虫期与蛹期马氏管蛋白质组的变化,为马氏管在不同发育时期的功能研究提供蛋白质水平上的依据。【方法】利用蛋白质双向电泳技术对家蚕5龄第5天及化蛹第1天的马氏管组织进行比较,并采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量差异较大的蛋白点进行肽指纹图谱鉴定,应用GPMAW 8.00软件对NCBI蛋白质数据库中所有来自于P50/Dazao的蛋白质与家蚕9倍基因组预测蛋白质库共同构建本地数据库,对试验采集到的肽指纹图谱进行分析。【结果】共检测到360-430个蛋白点,主要分布在分子质量15-80 kD、等电点4.0-9.5。2个时期共成功鉴定17个表达量有显著差异的蛋白质,其中包括与能量代谢相关蛋白质、热激蛋白、V型H+ ATP合酶、30K蛋白以及与肾脏功能密切相关的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶 2,3-羟基异丁酸脱氢酶等。【结论】本研究中差异蛋白质的发现和鉴定为完全变态昆虫幼虫期与蛹期马氏管的功能差异提供了蛋白质水平上的理论依据。     

Polycomb家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.     

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为：睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。     

桃豫矮砧1号矮化相关蛋白的双向电泳分析

为研究豫矮砧1号的矮化机理,以豫矮砧1号和毛桃不同生长时期(6,8,9月)的叶片为材料,运用双向电泳技术分析差异表达的蛋白。结果表明:添加硫脲的裂解液提取蛋白效果较好,以90μg蛋白上样量进行双向电泳,背景少、蛋白质斑点清晰、重复性高;用Image Master 2D软件对图谱进行分析,在豫矮砧1号6,8,9月份材料的2-DE图谱上分别检测到557,554,441个蛋白点,在毛桃6,8,9月叶片材料的2-DE图谱上分别检测到548,529,427个蛋白点;检测出16个差异表达蛋白,其中12个蛋白在豫矮砧1号6月份材料中特异表达,3个蛋白在豫矮砧1号8月份材料中特异表达,1个蛋白在豫矮砧1号和毛桃8,9月份叶片中均有不同水平的表达。     

茉莉酸处理烤烟打顶诱导烟碱合成调控相关蛋白质的筛选

为探索打顶促进烟株体内烟碱合成的调控机制以及茉莉酸(JA)信号途径在其中的作用,用JA处理模拟烟草打顶,采用差异蛋白质组学技术对烤烟根尖组织细胞蛋白质组进行分析.2-DE图谱经ImageMaster 2DPlatinum(Version 5.01)软件识别结果显示,约有500个蛋白质点被清楚分离,通过比较发现,打顶和JA处理后表达上调的蛋白质分别有13和26个,其中有3个共同蛋白质点;表达下调的分别有5和6个,其中有3个共同蛋白质点;特异表达点分别有8和5个,其中有4个共同蛋白质点.将其中8个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行了肤质量指纹图谱分析,Mascot软件对NCBInr数据库查询,8个特异蛋白质点得到了鉴定.其中4个蛋白质点在JA处理和打顶处理中的变化是相同的,表明这些蛋白质点可能受到茉莉酸信号途径的调控,同时又是刺激烟碱合成的重要因子.     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。     

利用双向电泳技术分离桃不同生长型差异蛋白

采用双向电泳技术(2-DE)对桃4种生长型的叶片蛋白质进行了分离,通过TCA/丙酮沉淀法,以180 μg上样量进行双向电泳,成功获得桃不同生长型的2-DE图谱.经Image Master 2D软件分析,发现大多数蛋白点分布于pI 4～7,分子量在14.3～66.4 kD 范围内;普通型(毛桃、大久保)2-DE图谱间蛋白点匹配率为64.86%,垂枝型(红垂枝、朱粉垂枝)为71.62%,矮化型(红寿星、粉红寿星)为70.28%,紧凑型(豫矮砧1号、紧凑罗曼)为53.92%;初步鉴定出9个差异蛋白点,其中包括1个普通型特异蛋白,3个垂枝型特异蛋白,1个矮化型特异蛋白,1个豫矮砧1号特异蛋白.     

苹果花芽孕育蛋白质组学初步分析

 【目的】苹果为中国乃至世界最主要果树之一，但由于童期长、其育种工作一直落后于其它作物。本研究旨在揭示苹果花芽分化机理，缩短苹果童期，加速苹果育种进程。【方法】运用蛋白质组学研究技术（双向电泳技术、生物质谱技术、生物信息学技术）对富士苹果树短枝停长后3～9周的花芽、叶芽进行蛋白质分析研究。【结果】短枝停长后第7周花芽形态分化开始，第7周花芽较叶芽的2-DE图谱有283个蛋白点在表达上有明显的质和量的变化。4个蛋白点（16.4、30.2、40.3、65.1 kD）为花芽形态分化开始时初前（花序原始体出现）花芽2-DE图谱所特有；3个蛋白点（39.3、60.2、66.3 kD）为初后（侧花出现）花芽2-DE图谱所特有，1个蛋白点（77.1 kD）为萼片期花芽2-DE图谱所特有。对富士苹果花芽形态分化开始时的4个特异蛋白点用基质辅助激光解吸P电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行肽质量指纹谱分析，并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测，初步认为第256号（16.4 kD）、298号（30.2 kD）蛋白点是未知蛋白，第327号（40.3 kD）蛋白点是与合成酶有关的蛋白，第367号蛋白点（65.1 kD）是一个与转录有关的RNA结合蛋白。【结论】富士苹果花芽形态分化开始时有16.4、30.2、40.3、65.1 kD 4个特异蛋白、侧花出现时有39.3、60.2、66.3 kD 3个特异蛋白、萼片出现时有77.1 kD 1个特异蛋白出现。16.4、30.2 kD是未知蛋白，40.3 kD是与合成酶有关的蛋白，65.1 kD是一个与转录有关的RNA结合蛋白。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系差异蛋白质组分析

【目的】对棉花晋A细胞质雄性不育系及其同核异质保持系MB177（JB）雄性败育关键时期的花药进行差异蛋白质组研究,为进一步揭示棉花细胞质雄性不育机理奠定基础。【方法】运用双向电泳技术对晋A细胞质雄性不育系及其保持系小孢子发育的造孢细胞时期和小孢子母细胞时期表达的蛋白质进行分离（考马斯亮蓝染色）;采用PDQuest8.0.1软件进行斑点检测,并经统计学分析确定获得差异表达蛋白质;对这些差异蛋白质斑点进行LC-Chip-ESI-QTOF-MS质谱分析,用Mascot软件搜索NCBInr绿色植物,鉴定差异表达蛋白质;对差异表达蛋白质进行GO和KEGG功能分析。【结果】PDQuest8.0.1软件分析表明,晋A不育系和保持系在花药发育的造孢细胞时期和小孢子母细胞时期的花蕾总蛋白质斑点数分别为1 525、1 540和1 554、1 540,这些蛋白质斑点的分子量分布在10-100 kD,等电点分布在3-10。经差异定量研究和统计学分析,共鉴定到15个在晋A不育系与保持系间显著差异表达的蛋白斑点,15个差异蛋白质斑点都得到了质谱特异峰图。对应的蛋白质H（+）-转运ATP合成酶、谷胱甘肽还原酶、线粒体上的ATP酶亚基、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基和UDP-D葡萄糖脱氢酶在不育系与保持系花药发育2个阶段均差异表达;膜联蛋白、S-甲酸谷胱甘肽水解酶、momilactone A 合成酶类似物、一个具有丙二烯氧化环化酶活性的未命名蛋白质和一个位于线粒体上的保守预测蛋白质仅在不育系和保持系花药发育的造孢细胞时期差异表达;β-羟酰-ACP脱水酶、丙酮酸脱氢酶-α亚基以及与花粉发育相关的一个预测蛋白质仅在不育系和保持系花药发育的小孢子母细胞时期差异表达。这些差异表达蛋白质主要参与小孢子与绒毡层发育过程,它们的下调或上调表达可能造成发育与代谢过程的不协调性,产生不正常的小孢子和绒毡层提前解体,从而导致雄性不育。采用荧光定量PCR分析核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因和H（+）转运ATP合成酶基因的转录变化,它们在转录水平与蛋白质表达的趋势一致。【结论】晋A不育系的小孢子败育可能与能量代谢紊乱、茉莉酸合成途径损害、细胞内大量ROS积累、查尔酮合酶活性下降有关。雄性不育的产生是一个复杂的生物学过程,涉及到多个基因的相互作用,构成了一个复杂的调控网络。     

Differential Proteomic Analysis of Leaf Development at Rice (Oryza sativa)Seedling Stage

To identify the function of differential expression proteins in different leaves of rice seedlings extracted from 2- to 5-leaf stages,the leaf proteins at the seedling stage of hybrid rice Shanyou 63 were studied by using the approach of plant proteomics,and those proteins were separated with two-dimensional electrophoresis (2-DE) and then analyzed with an imagemaster 2D Elite 5.0.The results showed that the 41 protein spots were detected differential expression,of which 17 new protein spots appeared after the 3-leaf stage,including 9 special protein spots,which were only detected at the 3-leaf stage.Thirteen protein spots increased first and then decreased in expression abundance gradually and finally even disappeared.For the other 11 protein spots,3 protein spots decreased,but 6 protein spots were opposite in expression abundance,however,2 protein spots expressed in an irregular pattern after the 2-leaf stage.Of the 41 differential leaf proteins,15 protein spots were identified by ESI-Q MS/MS and categorized into 4 groups of functions.The results indicated that proteins were the carders of the functions in cells,but were significantly influenced by the changes in cell function or intercellular environment;hence,the reason that caused the proteomic changes as mentioned earlier might be related to the occurrence of tillers at the rice seedling stage after the 3-leaf stage.     

利用双向电泳分析烯丙异噻唑诱导后水稻的蛋白质变化

本研究应用双向电泳(2-DE)技术分析了烯丙异噻唑诱导后水稻蛋白质的差异表达,所得的双向电泳图谱用PDQuest8.0.1软件进行分析,在诱导4d的双向电泳图谱上找到了10个差异表达蛋白质点,选取其中3个进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析,将所得肽段序列在数据库搜索比对后,找到了相匹配的蛋白,它们分别具有泛醌-细胞色素C还原酶、苏氨酸肽链内切酶和苹果酸脱氢酶活性。这些蛋白可能通过提高植物的呼吸作用和启动泛肽依赖性的蛋白质降解途径的活化来参与植物的诱导抗病机制。     

水稻生育后期蛋白质组差异表达的图谱分析

从蛋白质组学角度对水稻生育后期的叶片蛋白质组变化进行了研究,利用Imagemaster 2D Elite 5.0软件对所得到的双向电泳图谱进行分析比较,以揭示水稻叶片蛋白质组的表达差异。结果表明,经图谱分析共得到差异蛋白质点47个,其中孕穗期及抽穗期新增蛋白质点6个,21个随生育进程表达丰度增加,6个蛋白质点表达丰度逐渐减弱,其它14个蛋白质点呈无规则变化,多表现为在某个生育时期具有峰值;蛋白质是细胞功能执行者,受细胞功能或细胞环境变化的影响,因此,上述蛋白质发生变化的原因可能与水稻后期的发育转变有关系。     

番荔枝花发育不同阶段的差异蛋白质组分析

【目的】从蛋白质组学的角度研究番荔枝花发育不同阶段差异表达的蛋白质,分析相关信号通路,为揭示番荔枝花发育的分子机制提供理论基础。【方法】以番荔枝不同发育阶段的花为材料,采用双向电泳技术（Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）分离获得花芽（1 mm＜花芽＜2 mm）、花蕾（5 mm＜花蕾＜6 mm）、开花前期（花瓣轻微张开）及开花期（花瓣张开）等不同阶段表达丰度不同的蛋白点,利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术分析相关差异蛋白质,并对其进行功能注释。【结果】通过蛋白图谱比较分析发现,番荔枝花双向电泳图谱中的每张凝胶图谱中都可以检测到800多个重复蛋白点,其中在不同花发育阶段存在表达差异的有50个蛋白点。经质谱鉴定分析,并采用MASCOT软件在线检索,共检测到36个表达量相差2倍以上的蛋白点。36个蛋白质可分为7个主要的功能类别,这些功能类别包括：呼吸与能量代谢（11个蛋白质）,蛋白合成与代谢（8个蛋白质）,转录与翻译（3个蛋白质）,胁迫与防御（2个蛋白质）,细胞分化与增殖（3个蛋白质）,次生物质代谢（8个蛋白质）和未知功能蛋白（1个蛋白质）。通过GO分析,发现36个已鉴定的蛋白,分别归属于20个分类（term）。通过对差异蛋白进行定量分析,发现呼吸与能量代谢相关的蛋白中,3个蛋白（A07、C28、C42）随着花发育表达量不断下降,4个蛋白（A36、A37、B13、B29）表达则显著上升。在蛋白合成与代谢相关蛋白中,2个蛋白（A13和A22）在花发育的4个阶段都处于低水平表达,而另5个蛋白（B17、B20、A19、A21和C21）表达量显著上升。一个胁迫与防御相关蛋白（B32）在开花期,表达量达到最大值。2个细胞分化与增殖相关蛋白（B27和C57）表达量也呈逐渐升高的趋势。5个次生物质代谢相关蛋白（A06、A29、A34、C100和C110）随着花发育,表达量逐渐降低,而蛋白质C79和D38在花蕾阶段表达量达到最大值后,又逐渐下降。【结论】通过比较番荔枝花发育4个阶段的蛋白图谱,发现36个蛋白具有不同的差异表达谱。其中呼吸与能量代谢相关蛋白质占最大比例,诸如两个ATP合酶α亚基和丙酮酸脱羧化同工酶,都在番荔枝花发育过程呈现出显著的差异表达,这可能与花发育过程需要耗费大量的能量有关。此外,发掘了两个含有三角状五肽重复蛋白,其表达随着番荔枝花发育阶段的变化而改变,这些蛋白的功能还有待进一步研究。能量代谢、次生代谢、蛋白质合成等生物过程可能都参与了对番荔枝开花过程的调控。     

氮饥饿环境中稻瘟病不同致病力菌株分泌蛋白的双向电泳图谱分析*

 采用双向电泳技术研究了稻瘟病菌株Y99-63和Y98-16在氮饥饿条件下分泌蛋白群的组成及差异。在稻瘟病菌株Y99-63和菌株Y98-16分泌蛋白的2 DE图谱中分别检测出 262±10和253±10个蛋白质点。其中有130个蛋白质点为菌株Y99-63特异表达,121个蛋白质点为Y98-16特异表达,132个蛋白质点为两菌株共同表达。在两菌株共同表达的表达量相差达5倍以上的有38个蛋白质点,其中有25个蛋白质点在菌株Y99-63表达量较大,有13个蛋白质点在菌株Y98-16表达量较大。生物信息学预测稻瘟病菌分泌蛋白的分子量在10-20kDa以及等电点在5.0-5.5范围内蛋白质点数最多。菌株Y99-63特异表达分泌蛋白的分子量10-20kDa范围内蛋白质点最多, 菌株Y98-16特异表达分泌蛋白的分子量在20-30kDa范围内蛋白质点数最多,两菌株共同表达的分泌蛋白分子量在10-20kDa范围内蛋白质点数最多。菌株Y99-63特异表达分泌蛋白的等电点在5.5-6.0范围内蛋白质点数最多,菌株Y98-16特异表达分泌蛋白的等电点在4.5-5.0范围内蛋白质点数最多,两菌株共同表达分泌蛋白等电点在5.0-5.5范围内蛋白质点数最多。稻瘟病菌不同菌株在氮饥饿条件下产生的分泌蛋白有较大差异。