小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

BolSDG8 RNA干扰载体构建和拟南芥的遗传转化

拟南芥SDG8通过调控开花关键基因FLC位点上H3K36的甲基化水平促进其转录表达进而抑制植株早花。甘蓝Bol SDG8是拟南芥SDG8的同源基因,经比对,选择一段约为359 bp的保守序列,命名为Bol SDG8-RNAi,通过构建RNA干扰载体,并将其转化至野生型拟南芥(Col-0)中,获得了稳定遗传的转基因植株。通过对T3代转基因植物的表型观察,开花天数及莲座叶数目的统计分析,发现Bol SDG8 RNA干扰转基因植株表现出与拟南芥sdg8-2突变体相似的生物学表型,即植株弱小,明显早花,暗示Bol SDG8与拟南芥SDG8在调控植物开花上具有相似的生物学功能,为进一步深入研究甘蓝Bol SDG8的生物学功能奠定基础。     

NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化

根据枯斑三生烟草SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,分别扩增目的基因的正反向片段(约473 bp)。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL内含子右侧,正向目的片段插入该载体内含子左侧,再经NotⅠ酶切回收约3 916 bp目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段正反向重复序列的植物表达载体pART27-skp1sa。将pART27-skp1sa质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

雄性育性基因RNA干扰载体的构建与鉴定

1材料与方法1．1材料酶和试剂：各种限制性内切酶购自Roche公司,T4DNA连接酶购自上海生工公司,Taq聚合酶、dNTP、凝胶回收试剂盒均购自Promega公司,引物由上海生工公司合成,其他试剂均为进口或国产分析纯。植物材料和质粒：棉花洞A雄性可育株由西南大学棉花教研室提供,表达载体P^BП21质粒和大肠杆菌菌株XL1-Blue由西南大学生物技术中心实验室保存。pUCm-T克隆载体购自上海生工公司。     

水稻OsMED32基因RNA干扰载体的构建

水稻Mediator complex subunit 32(OsMED32)和哺乳类中的MED29以及酵母中的MED2属于同源基因,是主要的DNA结合转录因子。该研究利用RNAi技术,在克隆得到OsMED32基因全长序列的基础上,选取其中一段保守片段构建RNA干扰表达载体p1300-OsMED32 RNAi,使OsMED32在水稻中表达沉默,并转化至农杆菌EHA105中,为进一步研究OsMED32基因功能奠定了良好的基础。     

MsChiⅠ基因植物表达载体的构建及烟草转化

为提高紫花苜蓿的抗根腐病性能,采用限制性内切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)双酶切法,双酶切重组MsChi-pMD18-T质粒和表达载体PCAMBIA1302后,将MsChiⅠ基因与线性表达载体PCAMBIA1302进行定向连接,通过酶切和PCR验证MsChi-pCAMBIA1302载体构建正确性.采用快速冻融法,将表达栽体导入根癌农杆菌LBA4404中,转化烟草植株,对转化后的烟草植株进行PCR和RT-PCR检测.结果表明:成功构建Ⅰ类几丁质酶基因MsChiⅠ的植物表达载体MsChi-pCAMBIA1302,转化获得6株烟草转基因植株,目的基因已经成功整合到烟草的基因组中.     

银中杨DREB2A基因RNA干扰载体构建及转化农杆菌的研究

应用Gateway技术体系替代传统载体构建方法,构建了银中杨(Populus albaxp)DREB2A基因的RNA干扰载体,并将其转入根癌农杆菌EHA105中。该RNAi表达载体的构建对进一步研究杨树DREB2A转录因子基因的功能具有重要意义。     

拟南芥WUSCHEL基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

利用RT-PCR技术从拟南芥中扩增出WUSCHEL(WUS)基因,连接到诱导性表达质粒载体PINDEX3,构建出植物表达载体pIWUS,并通过农杆菌介导法导入烟草,PCR检测表明WUS基因已整合到烟草基因组中。     

RNA干扰技术及其在烟草中的应用研究进展

基因工程技术近年来在作物研究领域发展迅速,RNA干扰（RNAi）作为一项重要的基因沉默技术,具有高效性且特异性强的显著特点,现已广泛应用于后基因组时代,对研究作物基因功能,抗性和品质改良等有着重要作用。中国烟草研究已进入基因组时代,随着烟草基因组测序的开展,RNAi作为一门反向遗传学技术在烟草中的应用越来越多。本文介绍了RNAi 技术的作用机制和特点,重点介绍了RNAi在烟草基因功能研究、抗病研究、抗虫研究及烟草品质改良研究中的应用,并对RNAi 技术在烟草中的应用前景进行了展望。     

甘蓝型油菜丙酮酸激酶基因RNA干扰载体的构建

采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一个油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)基因。为构建甘蓝型油菜PK基因的RNA干扰(RNAi)载体,通过设计引物克隆了PK基因长498 bp的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Not I和Xho I酶切,酶切产物连接到RNAi平台载体pHurricane的Not I和Xho I位点,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,然后将上述PK基因反向重复框克隆到加入napin启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的PK基因的RNAi载体。限制性内切酶酶切证实载体构建成功,为进一步研究PK基因参与决定油菜油分积累的分子机理和代谢调控奠定了基础。     

水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

[目的]构建水稻osvdac3和osvdac5基因RNA干涉表达载体,获得转干涉载体的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到osvdac3和osvdac5的分别靠近5’端和3’端约500～600bp的特异序列,用Gateway重组克隆技术构建RNA干涉表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]成功构建水稻2个osvdac3和2个os-vdac5基因RNA干涉表达载体,并获得转osvdac3干涉载体的阳性植株。[结论]干涉osvdac3和osvdac5的植株为研究其功能提供材料。     

番茄生长素应答因子ARF1基因RNA干涉载体的构建及其对番茄的转化

将番茄生长素应答因子家族成员之一ARF1中的500bp左右的特异片段导入到植物载体pBI121中,构建成RNAi表达载体(pBI121-ARF1),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养和抗性筛选获得再生植株.PCR检测再生植株,初步鉴定为阳性植株,为后续进一步鉴定该基因功能奠定了基础.     

AtICE1和AtCBF1~3基因表达载体的构建与转化烟草研究

植物抗寒属于复杂的数量性状。单一基因转化,植株抗寒性提高有限。本文利用拟南芥的AtCBF1~3和AtICE14个基因构建植物表达载体pVCT2276,通过农杆菌介导法转化烟草,获得35株抗性苗。经抗性筛选以及PCR鉴定,8株显示为阳性植株。将其中5株繁殖成株系,为后续的抗寒鉴定奠定基础。     

棉花新品种抗枯、黄萎病性鉴定

棉花新品种抗枯、黄萎病性鉴定赵来顺，田学军（河北保定农业学校，保定０７１０５１）关键词棉花，黄萎病，枯萎病，抗病性ＩｄｅｎｔｉｆｙｏｎＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＮｅｗＣｏｔｔｏｎＶａｒｉｅｔｙｔｏＶｅｒｅｉｃｉｌｌｉｕｍＷｉｌｔａｎｄＦｕｓａｒｉｕｍＷ...     

将IL-2基因构建到叶绿体转化载体并转入烟草

以人白细胞介素2(IL-2)基因为目的基因,烟草accD和ORF184同源序列为侧翼引导序列构建成烟草叶绿体转化载体pAIL。以大烟草NC89为转化受体,通过基因枪方法对烟草叶片进行轰击转化。轰击参数为:每枪0.6μm的金粉300~500μg,轰击距离6 cm,真空度9.48×104Pa。在500 mg/L的壮观霉素筛选压下,经约30 d的筛选分化,逐渐产生绿色的抗壮观霉素芽或愈伤,目前已获得31株(丛)抗性芽及8块抗性愈伤。用IL-2基因的PCR引物对4株较大的小苗进行检测,初步证明3株为转基因植株。     

烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

蟠桃磷脂酶D基因RNAi表达载体构建

[目的]构建蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体.[方法]以英格尔蟠桃为材料,将CTAB改良法提取的蟠桃总RNA反转录成cDNA作为模板,通过RT - PCR扩增约347 bp的保守片段,将目标片段插入到pSK - int中间表达载体中,获得pSK - PLD - RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pCAMBI1301中,构建该基因的shRNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi.[结果]经限制性内切酶酶切和测序鉴定证明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi已构建成功.[结论]蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体的构建为进一步通过RNAi技术延长蟠桃果实的贮藏寿命奠定了基础.