运用DNA条形码技术鉴定茶园蜘蛛物种

运用DNA条形码技术,对广东潮州茶园蜘蛛物种进行了分子鉴定。本研究利用基因测序技术获取了凤凰山区域茶园50种蜘蛛的74条线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ, COⅠ)基因序列。使用邻接法(neighbor joining, NJ)构建系统发育树,运用ABGD(automatic barcode gap discovery)软件对蜘蛛样本进行聚类分析。结果表明:邻接法构建的系统发育树聚类结果与ABGD软件划分结果以及形态分类鉴定结果相一致,运用DNA条形码可以有效地对蜘蛛物种进行分子鉴定。这对茶园蜘蛛疑难物种和新物种的鉴定具有重要意义,在茶园蜘蛛物种多样性的研究中也具有重要价值。由此表明,基于COⅠ基因的DNA条形码对于本研究中所涉及的蜘蛛物种的划分具有较好的区分结果,可以作为一种有效的工具在茶园蜘蛛物种鉴定中进行应用。     

基于DNA条形码的广西苦瓜中实蝇幼虫分子鉴定研究*

实蝇是多种热带、亚热带水果和蔬菜的重要害虫,其卵、幼虫、蛹难以通过形态特征进行种类鉴定。DNA条形码是近年来出现的物种分子鉴定技术,能够实现对昆虫非成熟虫态的快速鉴定。本研究利用DNA条形码技术和BOLD系统,选取线粒体DNA细胞色素氧化酶I（COI）基因片段,针对采自于广西南宁地区苦瓜中的实蝇幼虫样品进行了序列测定、比对和分析。结果显示,在所检测的10头实蝇幼虫样品中,有4头为瓜实蝇［Bactrocera cucurbitae (Coquillett)］、6头为南亚果实蝇［Bactrocera tau (Walker)］。     

两种板栗重要蛀果象甲鉴别研究

栗雪片象Niphades castanea Chao和栗实象Curculio davidi Fairmaire幼虫形态相似,均蛀食板栗果实,是严重影响板栗产量或质量的重要害虫。为快速准确地鉴别这两种害虫,采用野外调查法和室内饲养法,对两种蛀果象甲的形态学和生态学特性进行了观察描述;同时对基于线粒体COⅠ基因片段的DNA条形码序列进行了提取扩增与分析。结果表明:栗雪片象和栗实象在成虫形态、为害特性和生活习性上差异明显;DNA条形码序列(COⅠ基因5′端684bp)可作为两种板栗蛀果象甲鉴定的分子标记,两者具有明显的碱基差异,遗传距离达18.9%~19.6%,在系统发育关系上,栗雪片象与Molytinae亚科的Niphadomimus sp.聚为一支,栗实象与Curculio属3个种聚为一支。研究结果可为两种板栗蛀果象甲幼虫的鉴别提供可靠依据,为象甲科昆虫的进一步研究提供形态、生态和分子证据。     

应用DNA条形码结合形态特征鉴定口岸船舶截获蛾类研究

口岸船舶检疫截获昆虫之中,鳞翅目蛾类占较大比例。然而,截获的蛾类标本外部形态常磨损严重,加之涉及类群多,所需参考资料广泛、复杂,给口岸船舶检疫截获蛾类的鉴定工作带来了许多困难。本文以海南出入境检验检疫局八所口岸船舶检疫截获的18头蛾类作为研究材料,通过DNA条形码技术批量初筛与外生殖器特征鉴定核查相结合的方法,对其进行鉴定。其中,10头蛾类标本通过线粒体COⅠ基因片段序列比对直接鉴定到种级水平,隶属于4科8属8种,经形态学特征检视复核,鉴定准确率为100%;其余8头标本依据线粒体COⅠ基因片段序列比对先鉴定到属,再进行外生殖器特征检视,鉴定为4科7属7种。本次鉴定出的15种蛾类之中,12种为全国口岸首次截获,3种为海南口岸首次截获。研究结果表明,DNA条形码技术批量初筛与形态特征鉴定复核相结合的鉴定方法,既能够解决传统形态鉴定对标本保存要求高、鉴定难度大的问题,有效提高检出率;同时又减少了检测周期,提高工作效率,为检验检疫部门截获蛾类的快速、准确鉴定提供重要参考。     

DNA条形码在昆虫学中的应用

DNA条形码技术是通过对一段标准化基因DNA序列的分析来实现对生物物种准确、快速鉴定的技术。自2003年提出以来,DNA条形码技术便备受关注,不仅被广泛地应用于生物分类学研究,也为生态学等学科的发展带来了机遇。昆虫是动物界的最大类群,目前条形码数据库中超过65%的序列都来自昆虫纲,DNA条形码的发展无疑为昆虫学带来了勃勃生机。本文综述了DNA条形码的产生、发展、优势及局限,总结并展望了DNA条形码技术在昆虫学基础研究与实践方面的应用。     

苹果异形小卷蛾的分子鉴定研究

苹果异形小卷蛾（Thaumatotibia leucotreta）是世界范围内重要的检疫性有害生物,对水果和农作物等生产具有重要影响,并影响国际贸易发展。本研究选用线粒体 COI 基因作为物种鉴定的条形码,结合 GenBank 数据库、BOLD 数据库比对和系统进化树构建,对2014年1月广州白云国际机场口岸入境加纳牛油果中截获的卷蛾科昆虫进行分子鉴定。根据 GenBank 数据库比对分析、NJ方法构建的系统进化树分析以及 BOLD 数据库查询分析,最终鉴定该样品为苹果异形小卷蛾。认为基于 DNA 条形码的分子鉴定能快速、准确地鉴定苹果异形小卷蛾。     

DNA条形码技术在小花蝽属昆虫分类鉴定中的应用

本研究利用DNA条形码技术对13种小花蝽属Orius Wolff昆虫进行了鉴定,进行了59条COI基因序列碱基组成及种内、种间遗传距离的分析,采用邻接法、最大简约法、贝叶斯推论法构建了系统发育树。结果表明,小花蝽属昆虫COI基因序列碱基组成与典型的昆虫线粒体DNA一致,A+T平均含量(66.4%)明显高于G+C含量,密码子的第3位A+T含量高达90.7%,碱基替换多为同义替换;13种小花蝽种内平均遗传距离为0.008,种间平均遗传距离为0.128,种内、种间遗传距离没有重叠区域。3种方法构建的系统发育树的聚类分析与形态学鉴定结果基本一致,除微小花蝽Orius minutus(Linnaeus)可能存在隐存种现象外,其他同一种群的不同个体单独聚为一支。利用DNA条形码技术对小花蝽属昆虫进行物种快速分子鉴定具有可行性。     

茶园茶黄蓟马及其近似种的DNA条形码鉴定

基于 mtDNA COI 基因的 DNA 条形码技术是一种新的物种鉴定手段,本文尝试应用该技术对6个不同地理种群的茶黄蓟马与茶园中的其他4种常见蓟马进行了鉴别。测定各种类 mtDNA COI 基因序列并在 BOLD 系统进行比对,采用 MEGA5构建系统进化树,结果表明基于 mtDNACOI 基因的DNA 条形码技术可实现对茶园中茶黄蓟马的快速鉴定。     

线粒体DNA序列在等翅目昆虫分子系统学上的应用

综述了国内外学者利用各种线粒体DNA序列来研究等翅目昆虫系统发育的研究概况.总结发现,CO Ⅰ、CO Ⅱ、12S rDNA、16S rDNA、Cyt b和ND1等线粒体区段被用于等翅目系统发育的研究,其中以COⅡ和16S rDNA的应用最广泛.而且多数是不同分子标记间的联合分析,解决了一些形态分类不能解决的问题.进一步的研究应与传统形态学研究结果相结合,可望全面分析等翅目昆虫的系统发育关系.     

基于mtCOⅠ基因的三种稻飞虱DNA条形码构建及应用

为构建白背飞虱、褐飞虱、灰飞虱3种稻飞虱DNA条形码,准确鉴定各虫态稻飞虱种类,随机选取35个供试虫体提取全基因组DNA,PCR扩增其中线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（mtCOⅠ）基因,分析所获得的基因组成特点,计算P距离值,构建系统发育树,并对稻飞虱若虫、卵进行种类鉴定。PCR扩增获得了长度为706 bp的稻飞虱mtCOⅠ基因片段,碱基组成特点种内、种间不同;3种稻飞虱的种间P距离值为25.53%~34.21%,种内为0~0.51%,种间值明显高于种内;系统发育树显示同种个体聚集在同一分支;同种卵、若虫的mtCOⅠ基因与已获得的成虫基因序列同源性最高值为100%,P距离值为0。研究表明,3种稻飞虱的DNA条形码可基于mtCOⅠ基因构建,且可准确鉴定各虫态。     

昆虫分子标记基因和序列及应用

本文综述了昆虫分子系统学中应用较广的核糖体DNA(rDNA)、线粒体DNA(mtDNA)、核蛋白编码基因和卫星、微卫星DNA等几类核酸分子标记基因和序列及其研究进展。检疫性害虫的分子检测可选择其中一种或多种分子标记基因。     

南部松齿小蠹和长林小蠹幼虫分子鉴定

小蠹幼虫在口岸中经常被截获。应用DNA条形码技术,对厦门口岸分别从美国进口的南方黄松和从澳大利亚进口的辐射松截获的小蠹幼虫进行分子鉴定,选用引物CJ-J-2183/TL2-N-3014对线粒体COⅠ部分序列,引物S3660/A335对核糖体28S部分序列进行PCR扩增和测序,并与Gen Bank中对应的序列进行比对。结果表明,从美国南方黄松截获小蠹幼虫样品COⅠ部分序列和28S部分序列与NCBI数据库中南部松齿小蠹同源性达99%,从澳大利亚辐射松截获小蠹幼虫样品COⅠ部分序列和28S部分序列与NCBI数据库中长林小蠹同源性分别达100%和99%;基于COⅠ和28S部分序列构建的系统发育树,两种小蠹幼虫样品分别与南部松齿小蠹和长林小蠹最为接近,根据序列分析和系统发育关系分析,将截获的小蠹幼虫鉴定为南部松齿小蠹和长林小蠹。     

果园螟蛾总科部分种类DNA条形码鉴定

为检验DNA条形码在鳞翅目螟蛾总科蛾类鉴定中的可行性,对采自山西省太原市晋源区螟蛾总科26种78头蛾类标本分别提取了DNA,扩增了全部78头标本的线粒体cox1基因和其中75头标本的核糖体28S基因,并通过构建系统发育树、计算遗传距离及种间差异阈值等方法,对所有标本进行了鉴定和比较分析,检验了国际DNA条形码数据库BOLD(the barcode of life data)系统的鉴定成功率。结果表明,基于cox1基因和28S基因的系统发育树鉴定成功率分别为100.00%和97.14%,BOLD系统的鉴定成功率达到了67.94%。基于最大简约法、邻接法和最大似然法构建的系统发育树,鉴定结果均相同。基于cox1基因的种内遗传距离全部小于1.00%,种内种间的遗传距离形成明显的3.00%阈值现象。研究表明,cox1及28S基因均适用于供试螟蛾总科种类的鉴定,核糖体28S基因可以作为DNA条形码鉴定的辅助基因;BOLD系统数据库仍有待充实,且标本鉴定工作相对滞后;不同聚类分析方法对结果影响很小,其中邻接法计算速度快,更适合DNA条形码大数据的分析。     

基于DNA条形码技术的泰国番石榴中实蝇幼虫分子鉴定研究

实蝇是世界重要的检疫性害虫之一,对果蔬生产及其国际贸易具有很大的影响。而以线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚单位I(mtDNACOI)基因的部分序列作为实蝇的DNA条形码能减少对实蝇成虫形态特征的依赖,可检测其任何虫态的样品,有助于实蝇样品的快速鉴定。本研究采用DNA条形码技术,针对采自泰国四色菊市番石榴烂果中的5头实蝇幼虫进行COI扩增测序,与生命条形码数据库(BOLD)中的序列进行比对并利用PAUP4.0软件构建了其系统进化树。根据序列分析和系统进化关系分析的结果,将5头实蝇幼虫样品鉴定为番石榴实蝇(Bactrocera correctaBezzi),并将本研究获得的2条COI序列在GenBank中注册,GenBank的登录号为HM590450和HM590451。     

植物病原细菌DNA条形码检测技术

植物病原细菌是植物病原菌的重要组成部分,DNA 条形码技术在植物病原细菌的鉴定中应用非常普遍,本文综述了在植物病原细菌鉴定中常用的基因及目前应用的一些数据库,认为在细菌鉴定中比较适用的方法为先通过16S rRNA 基因分析确定到属,然后通过多态性更强的基因或多个基因的联合应用鉴定到种或种下阶元。DNA 条形码技术可以作为常规检测技术的一个强有力补充,提高病原菌鉴定的标准化与速度,尤其对检疫性病原细菌的鉴定具有重要作用。     

线粒体COI基因作为根结线虫条形码的适用性分析

为评估线粒体COI基因作为根结线虫(Meloidogyne spp.)DNA条形码的适用性,对收集的25个根结线虫群体的线粒体COI基因进行扩增、测序,检测其扩增和测序成功率。将测序获得的COI基因序列与Q-bank中下载的根结线虫COI基因序列共同进行比对分析,利用MEGA 6.0计算种内、种间遗传距离进行"Barcoding Gap"检验以及构建NJ系统进化树作聚类分析,检验COI基因对根结线虫的物种识别能力。结果表明:线粒体COI基因扩增和测序成功率极高,扩增成功率达96%,测序成功率为100%。种间平均遗传距离为0.126,远远超过种内平均遗传距离0.002的10倍,种内遗传距离与种间遗传距离存在明显的"Barcoding Gap"间隔区。系统发育分析显示,COI基因可有效分辨出本研究15种根结线虫中的10种,物种识别率约为67%。线粒体COI基因具有极高的扩增和测序成功率、较高的物种识别能力,且扩增片段长度适宜,符合物种鉴定DNA条形码基因的标准,可作为根结线虫候选条形码基因。     

进境阿根廷原木中火蚁的鉴定

通过COⅠ序列相似性分析、系统发育关系分析和形态分类方法对从阿根廷进口原木中截获的火蚁属昆虫进行种类鉴定。对截获的火蚁虫体DNA进行扩增和测序,获得火蚁的线粒体COⅠ基因序列,并与GenBank中相应的火蚁属序列进行比对分析。结果表明,截获火蚁线粒体COⅠ基因序列与GenBank中Solenopsis interrupta的序列相似性为92.96%～98.39%,而与红火蚁S.invicta(EU311556)、S.saevissima(AY950779)和热带火蚁S.geminata(AY254489)的序列相似性分别为93.84%、95.85%和87.18%。以NJ法构建的系统发育树显示截获火蚁与S.interrupta最为接近,两者位于同一亚组。根据以上分析及观察结果,将截获火蚁SHCIQFA1-2鉴定为Solenopsis interrupta。     

拟禾本科根结线虫形态和分子鉴定

在浙江杭州富阳区中国水稻研究所试验田水稻根际土壤中发现了大量根结线虫2龄幼虫和少量雄虫。2龄幼虫的形态学特征与已报道的拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)基本一致。进一步通过对核糖体DNA(rDNA)18S、28S和ITS基因,以及线粒体COⅠ基因进行扩增和测序,并在Genbank中与已登录的拟禾本科根结线虫序列比对,发现其相似度高达99%～100%。在Genbank中登录其序列并构建系统进化树后,发现rDNA ITS和线粒体COⅠ可以作为快速鉴定拟禾本科根结线虫的基因,能将其与其近似种完全区分。     

基于线粒体COⅠ基因及形态特征的喜树丛枝植原体主要媒介昆虫种类鉴定

植原体病害是喜树上危害最严重的病害之一,传播喜树植原体病害的主要媒介昆虫是喜树上的一种小绿叶蝉,为进一步分析媒介昆虫传播植原体机制以及植原体在昆虫体内的侵染循环过程,为植原体病害的科学防控提供参考,媒介昆虫的种类及分类地位必须先行明确。通过网捕法采集云南文山喜树上的小绿叶蝉标本,在体视显微镜下根据各龄期外部形态以及雄性外生殖器特征进行种类鉴定,结合PCR扩增线粒体COⅠ基因序列片段进行测序和比对,利用Kimura 2-parameter模型计算出平均遗传距离并用最大似然法构建系统发育树,进一步明确其分类地位,再根据前人制作的属及亚属分类检索表明确其分类地位。共检视并解剖小绿叶蝉雄虫标本100余头,提取20余头DNA进行测序,得到16条709 bp大小的COⅠ基因序列片段,结合NCBI上相关的叶蝉COⅠ序列,建立基因进化树。综合分析其外部形态、雄性外生殖器特征以及COⅠ序列比对,明确了喜树丛枝植原体主要媒介昆虫是拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis Zhanget Liu-CA,分类地位为小绿叶蝉属Empoasca Walsh, 1862,...     

珠海口岸全国首次截获重要害虫鳄梨织蛾

2018年1月珠海检验检疫局首次从旅客携带的厄瓜多尔鳄梨中截获我国进口墨西哥、秘鲁鳄梨议定书中关注的检疫性有害生物——鳄梨织蛾(Stenoma catenifer),本文对该虫的寄主、分布及形态特征进行了详细描述。文中应用DNA条形码技术扩增了该虫的线粒体COⅠ序列,通过GenBank数据库比对分析,邻接法构建的系统发育树及BOLD数据库查询比对。结果与GenBank数据库中2条及BOLD数据库中11条鳄梨织蛾序列97%以上一致;构建的系统发育树显示截获样品与鳄梨织蛾聚为一支。因此,综合形态和分子数据确定所截获的有害生物为鳄梨织蛾。