棉花GhFLA4基因的克隆及表达分析

[目的]分离棉花中的阿拉伯半乳聚糖蛋白.[方法]以陆地棉18DPA棉纤维cDNA为模板,RT-PCR扩增获得GhFLA4基因全长cDNA序列.[结果]序列比对分析发现该cDNA包括阅读框732 bp,编码244个氨基酸,与二穗短柄草、葡萄、火炬松等序列的同源性分别为60;、59;、54;.qPCR结果表明,GhFLA4基因在根、茎、叶中均有表达,但在纤维细胞中优势表达.利用Gateway技术将GhFL44基因融合到含GFP的双元表达载体pGWB5中,转化农杆菌并注射烟草叶片,发现该基因定位于细胞核及细胞质内.原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,诱导产物中含有一条与理论值相符的29 KDa融合蛋白.[结论]推测GhFLA4可能在棉花纤维伸长至次生壁合成的重叠期发挥着信号传导作用.     

海岛棉与陆地棉纤维C4H1基因克隆及表达分析

[目的]研究海岛棉与陆地棉纤维不同发育时期C4H1基因的表达和结构差异.[方法]分别从海岛棉和陆地棉纤维中克隆C4H1基因的cDNA全长,并利用DNAMAN、MEGA3.1等软件进行C4H1基因的生物信息学分析;采用半定量和实时荧光定量PCR方法,比较海岛棉和陆地棉不同发育时期的棉纤维中C4H1基因的表达水平.[结果]C4H1基因在海岛棉与陆地棉纤维发育不同时期表达具有差异,海岛棉中该基因的表达高峰期在20 DPA,而陆地棉中该基因的表达高峰期在15 DPA.该基因的核酸序列在两种棉花中存在差异,并导致其编码蛋白的氨基酸序列也存在差异,且海岛棉C4H1蛋白中Thr(苏氨酸)含量高于陆地棉,蛋白等电点也耍高于陆地棉.[结论]海岛棉中C4H1基因的表达高峰期晚于陆地棉,两个棉种C4H1蛋白氨基酸序列的差异可能导致其理化性质及生物学功能的改变,为发掘海岛棉纤维品质优异基因奠定了基础.     

赛买提杏自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

[目的]克隆新疆主栽杏(Prunus armeniaca)赛买提自交不亲和性花粉SFB基因全长序列,为今后通过分子改良培育具有自交亲和性的赛买提杏奠定基础.[方法]通过RT-PCR法克隆获得赛买提杏花粉SFB基因中间片段,RACE技术克隆cDNA全长,DNAMAN预测其氨基酸序列,并将编码蛋白与自交亲和的杏SFBC基因进行比对.[结果]克隆到1个全长为1 373 bp的SFB基因,命名为SFB60(GenBank登录中).该基因包含1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸.与SFBC基因相比,该蛋白有2个变异区(V1和V2)和2个高变区(HVa和HVb),N端有一段由42个氨基酸组成的F-box结构域,而SFBC基因缺少2个高变区.[结论]获得了赛买提杏花粉自交不亲和SFB60基因cDNA全长序列,为进一步以分子育种的方法来改良赛买提杏的研究奠定了基础.     

棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

[目的]研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料.[方法]以50 mg/L赤霉素(GA3)和250 mg/L乙烯利(CEPA)分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester,H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库,反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列,然后进行基因功能注释与功能分类,并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律.[结果]以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为GA文库;以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为CE文库.从构建的两个消减文库(GA和CE)中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列,通过基因功能注释与功能分类,可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类,其中与翻译相关的EST序列占24.14%,说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成.从消减文库中挑选10个差异表达基因(EST序列)进行RT-PCR分析,结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化.[结论]棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达,进而影响器官脱落,是其对逆境胁迫反应的结果.     

三黄鸡MAVS基因克隆及生物信息学分析

[目的]掌握三黄鸡线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因的生物信息学,为MAVS基因诱导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础.[方法]根据GenBank中已公布的原鸡MAVS基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR扩增三黄鸡MA VS基因,并应用相关生物软件进行序列分析及其蛋白结构预测.[结果]三黄鸡MAVS基因编码区(CDS)全长1926 bp,编码641个氨基酸,与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列(NP 001012911.1)比对,三黄鸡MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异,分别为440A→T、488P→L、506I→L和606E→K.三黄鸡MA VS基因与原鸡的相似性最高,达99.0%;与日本鹌鹑的相似性次之,为91.0%;与斑马鱼的相似性最低,仅37.6%.三黄鸡MAVS蛋白分子质量为67.79ku,理论等电点(pI)为5.04,属于跨膜蛋白,无信号肽序列;其二级结构中折叠占0.5%,无规则卷曲占88.7%,螺旋占10.8%.[结论]三黄鸡MA VS基因序列表现出高度的保守性,可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一.     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础.[方法]采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平.[结果]铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05.铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右.该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白.CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CH基因的表达量降低,茎中的表达量升高.[结论]铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成.     

棉花GhGGPase基因克隆、序列分析及原核表达

[目的]棉花GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GhGGPase)基因的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]利用RT-PCR技术从棉花纤维中克隆棉花GhGGPase基因,进行生物信息学分析,构建原核表达载体pET28a-GhGGPase,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达.[结果]从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因的cDNA开放读码框为1350 bp,为包含450个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为49 kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,GhGGPase蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域.进化树分析的表明棉花GhGGPase与柑橘CuGGPase在进化上亲缘关系上较近.成功构建了pET28a-GhGGPase原核表达载体;获得分子质量约为49kDa左右的重组蛋白GhGGPase.半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhGGPase基因与棉纤维的快速伸长发育密切相关.[结论]GhGGPase基因的克隆、序列分析和重组蛋白的诱导表达为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

[目的]DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用.研究棉花中DELLA基因的功能.[方法]从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型.[结果]序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域.采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47;以上.转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型.[结论]过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育.     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

棉花GhSP1L基因克隆与表达分析

[目的]棉花Spiral1-LIKE(SP1L)基因(GhSP1L)的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]通过RT-PCR从棉纤维中克隆GhSP1L基因,进行GhSP1L蛋白的功能结构域分析,构建原核表达载体pET28a-GhSP1L,进行蛋白体外诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达情况;RT-PCR检测GhSP1L基因的表达特征.[结果]从陆地棉纤维组织中克隆得到GhSP1L基因的全长cDNA,其开放读码框为318 bp,编码106个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为11.76kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,其N端和C端较为保守,含有SCOP结构域,属于SP1L家族蛋白,能够在其他微管蛋白协助下与微管结合,SPR1的定位可能与其结合的微管结合蛋白相关.构建了pET28a-GhSP1L原核表达载体,并通过体外诱导表达后获得分子质量约为12 kDa左右的重组蛋白GhSP1L;半定量RT-PCR结果表明,GhSP1L基因开花后3d的纤维组织中表达量较高.[结论]GhSP1L基因的克隆、序列分析和表达,重组蛋白的诱导表达,为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(Gm VTE3)的克隆及对转基因烟草种子中生育酚组成的影响

【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3,它能够催化烟草植株中2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)的甲基化,从而改变烟草种子中生育酚的组成成分。说明可以利用克隆的GmVTE3来改变植物种子中生育酚的组成和提高α-生育酚的含量。     

草莓EST中SSR位点分析

[目的]从现有的草莓EST数据中获取有效的微卫星标记。[方法]利用MISA（Microsate llite）软件分析简单重复序列（Simple se-quence repeat,SSR）在草莓EST中的分布频率与密度,用CAP3软件进行冗余分析。[结果]在17565条EST序列中,共获得10129条SSR序列,SSR之间的距离约为0.90kb。其中,六碱基重复丰度最大,占61.0%,而三碱基、单碱基、二碱基、四碱基和五碱基重复丰度分别为14.3%、13.1%、6.2%、4.3%和1.1%。在单碱基、二碱基、三碱基和四碱基重复模体中,丰度最大的分别是A/T、AG、AAG和AAAG,而CG在编码区内没有。在这6种类型的重复模体中,冗余与非冗余的草莓EST之间没有显著差异。[结论]从现有的草莓EST数据中可以方便地获取有效的微卫星标记。     

茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性研究

[目的]研究茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性。[方法]选用来源于茶树EST序列的7对EST-SSRs引物,对山茶科植物的19份材料进行了扩增。[结果]7对EST-SSRs引物中有5对引物能对19个供试材料进行有效扩增,通用性比率为71.43%;扩增率最高的为云南山茶凤山茶、华东山茶彩霞和云南山茶菊瓣,最低的为川滇莲蕊茶和大花杨桐;有效扩增的5对引物对中有4对引物在供试材料中表现出丰富且差异明显的多态性。[结论]从茶树基因组上开发的SSR引物在山茶科植物不同种属植物间有较高的通用性,可用于山茶科植物比较基因组研究和分析标记研究。     

一个麻疯树AP2/ERF家族基因的克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆1个麻疯树AP2/EFR家族的基因,并构建其植物表达载体。[方法]利用麻疯树EST数据库中的AP2/ERF相关信息设计引物,通过RT-PCR克隆麻疯树AP2/EFR家族的基因,用生物信息学方法对其序列进行分析,并构建其植物表达载体。[结果]试验克隆到1个AP2/EFR家族基因JcERF;从cDNA序列、氨基酸序列、保守域序列、功能组成、理化性质、进化树等方面进行分析,结果显示JcERF属于AP2/EFR家族中的ERF亚家族;将JcERF连接至pCAMBIA1301载体上,构建了以35S为启动子的植物表达载体。[结论]该研究为麻疯树中JcERF的功能研究及提高麻疯树的抗逆性奠定了基础。     

鲤鱼干扰素γ-2β全长cDNA的克隆及序列分析(英文)

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(interferon γ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆。对其序列分析结果显示,该序列包含119bp的5’非编码区,218bp的3’非编码区,开放阅读框ORF长537bp,共编码178个氨基酸,在其3’非编码区存在几个ATTTA不稳定基序。序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列其具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性研究（摘要）

[目的]研究茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性。[方法]选用来源于茶树EST序列的7对EST-SSRs引物,对山茶科植物的19个种进行了扩增。[结果]7对EST-SSRs引物中有5对引物能对19个供试品种进行有效扩增,通用性比率为71.43%;扩增率最高的为云南山茶凤山茶、华东山茶彩霞和云南山茶菊瓣,最低的为川滇莲蕊茶和大花杨桐;有效扩增的5对引物对中有4对引物在供试材料中表现出丰富且差异明显的多态性。[结论]从茶树基因组上开发的SSR引物在山茶科植物不同种属植物间有较高的通用性,可用于山茶科植物比较基因组研究和分析标记研究。     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆及序列分析

[目的]为研究以鼠兔LDH-C4为靶蛋白的节育型鼠药奠定基础。[方法]采用简并引物PCR克隆得到黑唇鼠兔LDH-C基因的EST序列,再根据EST序列采用RACE技术克隆出基因的开放阅读框（ORF）全长,和3’UTR序列。[结果]整个cDNA全长1 498 bp,其中ORF长996 bp,编码332个氨基酸,3’UTR长486 bp。ORF序列比对显示LDH-C基因在大的分类单位上均很保守。系统树分析显示黑唇鼠兔的LDH-C基因和灵长类及偶蹄目的遗传距离较近,和啮齿目较远。[结论]成功的克隆得到了黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA序列。     

干旱和盐碱共胁迫玉米EST数据库分析

[目的]构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库,对细胞功能相关基因表达进行初步分析。[方法]提取处理玉米YQ7-96品系的雌雄分化期（12片叶龄）的混合组织（叶、茎和花芽）总RNA,运用SMART技术构建pDNR-LIB载体的cDNA文库,并随机挑选克隆进行EST序列的B lastX比对和MIPS归类分析。[结果]随机挑取3 027个cDNA克隆进行测序,94.45%的EST长度大于400 bp,共获得1 861个单基因簇,其中维持正常生理活动的基因占65.36%;参与细胞内运输、细胞内信号传导、细胞防御和细胞循环和DNA代谢过程的基因分别占9.26%、6.58%、2.63%和3.16%。[结论]在成功构建干旱和盐碱共胁迫的玉米cDNA文库的基础上,对产生的EST进行了测序和分析归类,筛选出了细胞功能相关EST,为后续研究奠定了基础。     

鲤鱼干扰素γ-2β 全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]进行鲤鱼干扰素γ-2β(IFNγ-2β)全长cDNA的克隆、鉴定及序列分析。[方法]以鲤鱼外周血白细胞干扰素γ-2β(inter-feronγ-2β,IFNγ-2β)EST序列为基础,以地高辛标记作为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IFNγ-2β的全长cDNA,并进行序列分析。[结果]获得了3个阳性克隆,对其进行序列分析,结果显示,该序列包含119 bp的5'非编码区,218 bp的3'非编码区,开放阅读框ORF长537 bp,共编码178个氨基酸,在其3'非编码区存在几个ATTTA不稳定基序;序列同源性比较结果表明,所获序列与GenBank上登录的鲤鱼IFN基因的同源性达97%;蛋白质序列和结构分析发现,该序列具有IFN家族的典型序列特征。[结论]为进一步研究IFNγ-2β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

叶蝉EST资源的微卫星信息分析

【目的】分析叶蝉EST序列信息,为其分子标记体系建立、遗传图谱构建及相关致害基因挖掘奠定基础。【方法】利用生物信息学技术对NCBI数据库中的4种叶蝉亚种EST序列进行SSR基序分析与统计,并对筛选出的SSR基序区段进行引物设计,开发出SSR标记。【结果】11044条叶蝉EST序列的总长为5866kb。按照引物筛选设定的参数,筛选获得1946条含有SSR基序的EST序列,占总EST序列的17．6％;其中包含2230个SSR基序并全部获得相应的SSR引物,平均间距为2．63kb。在2～5个核苷酸重复中,3个核苷酸重复为优势基序,占总基序的77．3％,尤以AAT类最丰富,占3个核苷酸重复总数的40．7％;双核苷酸重复中,AG类所占的比例最大,为39．1％。【结论】从叶蝉EST序列中筛选获得2230个SSR引物,以3个核苷酸重复基序所占比重最大。