猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及N基因序列分析

[目的]了解引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒是否为变异株.[方法]从疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场采集死亡仔猪的肠黏膜及其内容物,将病料常规处理后接种VERO细胞,采用维持培养液加10 μg/mL的胰酶的方法分离培养.用RT-PCR、间接免疫荧光、动物回归实验以及部分序列分析等方法对分离株进行鉴定.[结果]病料在接入细胞第一代即出现病变,细胞肿胀变圆,形成合胞体,逐渐脱落,细胞病变明显.随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐稳定,进行RT-PCR检测、间接免疫荧光检测以及动物回归实验,最终确定分离株符合PEDV特征,并命名为BJ2015,测定毒株的TCID50为10-6.4/0.1 mL.基因测序结果显示,N基因长1 329 bp,编码442个氨基酸.与参考株N基因核苷酸序列比对及遗传进化分析表明,BJ2015与传统株CV777亲缘关系较远;与流行变异株BJ-2011-1N基因在进化树的同一个分支上,二者的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6％、99.5％,表明BJ2015与BJ-2011-1亲缘关系较近.[结论]结果表明BJ2015为PEDV流行性变异毒株.     

闽西地区猪流行性腹泻病毒N基因分子进化及序列分析

分析闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的遗传进化特征,收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份,用逆转录PCR(RT-PCR)扩增N基因,连接至pMD-18T载体进行测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示,8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%,推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明,闽西毒株氨基酸序列存在15处突变,与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株,与疫苗毒株亲缘关系较远,可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株,不能给猪群提供很好的免疫保护,因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。     

3株猪流行性腹泻病毒M基因克隆与序列分析

【目的】了解近年来京津冀地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株M基因的变异情况。【方法】用RT-PCR技术从京津冀地区部分仔猪腹泻样品中扩增与克隆3株PEDV流行株M基因全长序列,并进行序列测定和分析。【结果】基因序列结果显示,3株PEDV的M基因全长均为681nt,其核苷酸同源性达99.7%以上,在系统发育进化方面属于同一簇。M基因系统发育进化关系显示,虽然这3株PEDV与中国以前PEDV流行毒株及疫苗株CV777属于不同的簇,但其与国内外其他PEDV参考毒株的核苷酸同源性均达96.5%以上。【结论】M基因仍然是检测PEDV的良好目的基因。     

2014—2018年猪流行性腹泻病毒N基因遗传变化分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的分子流行病学情况,采用RT-PCR方法对2014—2018年采集到的河南、河北、山东、山西、甘肃、湖北、江西以及上海8省市共205份疑似PEDV阳性病料进行PEDV检测,使用RT-PCR方法扩增得到PEDV的N基因片段,回收PCR产物并与pMD20-T载体进行连接,挑选阳性克隆进行测序,分析研究PEDV遗传变异情况。结果显示,205份样品中,有191份样品为PEDV阳性,共得到19株PEDV的N基因序列,N基因全长均为1 326 bp,没有碱基的缺失和插入;将检测到的PEDV的N基因序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸的同源性为94.8%～99.5%,氨基酸的同源性为95.0%～99.3%。进化树分析发现,得到的19株N基因序列与CV777、CH-S等国内外毒株亲缘关系较远;其中,16株与MN、USA-Indiana-2013、USA-Iowa107-2013等近年分离株在一个分支上,为G2a亚群;CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CH-HENZMDPY-2017这3株序列形成另一个分支,为G2b亚群。综上可知,我国PEDV流行广泛,病毒变异频繁。研究结果可为新型疫苗研发以及检测方法的建立奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒5株安徽流行株M基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明,5株PEDV安徽流行毒株M基因的全长均为681 bp,编码226个氨基酸,核苷酸同源性为99.1%～99.9%,其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%～100%。进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuated DR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。     

变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

[目的]体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.[方法]将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白.通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性.[结果]扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%.将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%.以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体.[结论]通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

【目的】 利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp ,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】 初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。     

安徽省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

【目的】研究安徽地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ORF3基因序列特征。【方法】于2012-2013年,从安徽省合肥、肥东、肥西、滁州、亳州、阜阳、马鞍山、蚌埠、宿州、巢湖、六安、淮南、宣城和淮北地区的19个不同猪场采集93份病料,采用RT-PCR方法对PEDV ORF3基因进行扩增,测序后进行序列分析,并与韩国、欧洲及中国其他省份PEDV毒株进行同源性比较,并构建遗传进化树。【结果】在93份病料中,自20份病料中获得的PEDVORF3基因开放阅读框全长为810bp,编码224个氨基酸,较多的基因位点发生了突变,没有缺失和插入。安徽省PEDV毒株之间的同源性为96.7%~100.0%,与欧洲株同源性为94.9%~97.0%,与韩国株同源性分别为96.3%~98.7%,与中国其他省份分离株的同源性为95.9%~100.0%。【结论】安徽地区PEDV ORF3基因与韩国株亲缘关系较近,而与欧洲株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定

上海市农业科学院畜牧兽医研究所在上海郊区分离到一株猪流行腹泻病毒，以人工攻毒发病猪的小肠粘膜无菌处理后接种已长成单层的ＶＥＲＯ传代细胞，并在维持液中加入胰酶５０μｇ／ｍＬ和２％的小牛血清。     

猪流行性腹泻病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为研究2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场是否有猪流行性腹泻病毒的感染与流行,对猪流行性腹泻病毒ORF3(Open reading flame 3)基因进行克隆及序列分析研究。通过从疑似流行性腹泻病毒感染的猪场采集小肠组织,采用RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒的ORF3基因进行克隆。结果表明,所获得的ORF3基因ORF长675bp,编码223个氨基酸。通过DNAMAN软件分析,表明本研究中克隆的ORF3基因与CV777标准株(AF353511)的ORF3基因相似性为96.45%,与中国的NJ(KJ642645)的相似性最高,为99.41%,与attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%,而与CV777疫苗株(GU372744)相似性仅79.07%。系统进化树分析表明,该基因与中国毒株、韩国毒株以及美国分离株USA/Illinois 201/2014(KR265795)处于同一进化分支上,而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和欧洲的CV777标准株处于另一个进化分支上,说明该基因与中国毒株、韩国毒株的遗传距离最近。通过B细胞抗原表位预测分析,发现其氨基酸第65~68、114~116、137~140和150~154区域可能有潜在的优势抗原表位。成功克隆了猪流行性腹泻病毒ORF3基因,说明2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场存在猪流行性腹泻病毒的感染。     

上海地区新发猪流行性腹泻病毒的鉴定及分析

目前,仔猪腹泻病严重危害我国生猪养殖业,利用核酸分析技术我们对今春导致上海地区多个猪场仔猪腹泻病的病原体进行了鉴定,结果显示,猪腹泻病病毒(PEDV)是致病元凶.在此基础上,我们利用PEDV特异性引物,克隆了上海地区流行毒株的结构蛋白基因S、N和M,并根据保护性抗原S1基因序列比对,分析了此病毒株与其他相关毒株的亲缘关系.结果表明,上海地区PEDV流行株与2010年来我国各地发生的多数猪腹泻病毒亲缘关系接近,而与传统病毒株如CV777和周边日本和韩国近年来流行的毒株存在一定的差异.另一方面,分析还表明,近年来我国不同地区流行的PEDV存在着异质性,亲缘关系存在差异.通过这些分析,提示当前急需研制新的疫苗尤其是减毒活疫苗对PEDV予以预防.     

小反刍兽疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的PPRV基因组序列,设计并合成2对特异性引物,以PPRV疫苗株基因组为模板,经RT-PCR扩增获得N和M基因并进行序列分析,再将2个基因插入到原核表达载体pET-28a中,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因,重组菌经IPTG诱导后表达分子质量为57.7ku N蛋白(核衣壳蛋白)和38.1ku的M蛋白(基质蛋白),2个蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。     

猪传染性胃肠炎及流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的序列,利用Primer 5.0设计合成了2对特异性引物。用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化,然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件,结果同时扩增到2条与实验设计相符的492bp(PEDV)和211bp(TGEV)特异性条带,建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法,可检测出约11pg的PEDV和13pg的TGEV。     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株S蛋白的表达鉴定

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种可致仔猪严重腹泻的高度接触性肠道传染病。S蛋白在病毒感染和入侵宿主细胞的过程中具有重要作用。为了研究S蛋白的特点,本研究扩增了PEDV新流行毒株SHpd/2012的纤突蛋白S基因分段片段S11、S12、S13、S21和S22,将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、鉴定,获得了正确的PEDV S的分段蛋白S11(24-277aa)、S12(272-571aa)、S13(560-797aa)、S21(793-1109aa)及S22(1102-1384aa),为后续单克隆抗体的制备和致病机制的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒陕西渭南株的遗传变异

从陕西省渭南某规模化猪场采集疑似猪流行性腹泻(PED)仔猪病料进行病毒检测,旨在从基因遗传变异方面分析疾病发生的可能原因。通过RT-PCR从疑似仔猪20份小肠样品中检测到9份PED病毒阳性样品,并扩增出PED病毒M、ORF3和S基因的部分序列。序列分析结果表明,与CV777疫苗株对比,样品渭南(WN)株PEDV M基因高度保守,同源性为98.2%;ORF3基因存在11处碱基突变,同源性为98.2%;S基因突变较大,存在4个插入区域,分别是164~166、177~179、181~186和416~418nt,内分核心中和表位区(COE,499~638位氨基酸)存在9个氨基酸突变位点。遗传分析显示,WN株M基因与中国近期分离毒株亲缘关系较近;ORF3基因与同处在G1群中的中国毒株亲缘关系较近,而与CV777疫苗株亲缘关系较远;S基因与中国早期分离毒株及CV777疫苗株亲缘性较远,与当前的流行株亲缘关系密切。这些结果表明,WN株与CV777疫苗株相比,有明显的遗传变异倾向,可能导致目前PEDV疫苗免疫效果下降,PED疫情大规模流行。     

鸡传染性法氏囊病毒BJ 10株分离鉴定及其VP2基因序列分析

分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV),并对其VP2基因进行序列分析。从陕西宝鸡地区疑似疫情的鸡群分离到1株IBDV（命名为BJ 10株）,应用血清学琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion test, AGID),结果在抗原孔和血清孔间可见明显的白色沉淀线。通过RT PCR扩增VP2基因高变区并对其进行生物信息学分析,结果表明,BJ 10株与超强毒株中国香港HK46的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.7%和 99.6%,且高变区特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,表明BJ 10株属于超强毒株,与香港地区的vvIBDV分离株有较为密切的亲缘关系。     

猪流行性腹泻病毒的鉴定及其S基因的序列分析

为确诊河南某猪场仔猪腹泻的病原,进一步了解该猪场PEDV流行毒株S基因的变异情况,对临床采集疑似PED的病料进行检测,并对检测结果为PEDV阳性的毒株进行S基因序列分析。结果显示,采集的病料均为PEDV阳性,S基因的进化分析显示,该猪场PEDVS基因推导的氨基酸序列之间的同源性高达99%,与国内其他毒株均位于G2-b进化分支,研究结果为进一步掌握该地PEDV的流行毒株及毒力变异情况提供理论依据。     

多杀性巴氏杆菌分离鉴定及序列分析

旨在了解新疆地区多杀性巴氏杆菌主要流行株的特性。通过病原的分离纯化、PCR扩增及测序,分析8株多杀性巴氏杆菌的血清型,16S rDNA基因、ompH基因和ompA基因的差异。结果表明,3株羊源、2株牛源和1株禽源分离株为荚膜A型,1株牦牛源分离株为荚膜B型,1株标准株为荚膜E型,均具有很强的致病性。分离株与GenBank公布的代表株的16S rDNA基因、ompH及ompA基因同源性分别为93%~100%、93%~100%、98%~100%。ompH基因的ORF氨基酸C端最后10个氨基酸变化较大,分离到5株ompA基因的ORF氨基酸序列N端多出6个氨基酸（M-K-R-I-I-Q）替代原先的起始位置。可见：新疆主要流行株为强致病性的荚膜A型,且有出现变异趋势。