伪狂犬病病毒Ea株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上，下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒，pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了 gD基因的可靠性和完整性，同时构建了测序质粒pSKgDSB,pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序，将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残苦水平上也有差异。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了1对PCR引物，以伪狂犬病病毒Ea株(pseudorabies virus Ea，PRv Ea)基因组DNA为模板．扩增出一大小为511bp的片段。通过酶切和测序证实，该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因，即gL基因。Blast软件分析表明，该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为94％，氨基酸序列的同源性为95％。将测序结果输入GenBank，获得登录号AF448456。     

伪狂犬病病毒Ea株gE基因的克隆、序列分析及其表达

对含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PrV）Ea株gD基因部分编码序列，gI、gE和11k基因全序列、28k基因部分序列的质粒pSKB4.5进行亚克隆，构建了只含完整gE基因（长1.78kb）的重组质粒pSDM1.78 ，并采用双脱氧末终止法对全序列进行了分析，发现同国外标准毒株Rice株相比较，在核苷酸和氨基酸水平均存在一定程度的差异。进一步将gE基因克隆到高效真核表达载体pcNDA3.1 的Kpn1和BamH1位点之间，构建了gE基因的真核表达质粒pcDNA-gE。体外转染IBRS-2细胞，经间接免疫荧光法检测证实了gE基因在IBRS-2细胞中得到了表达，表达的蛋白具有生物学活性。     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRV Fa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1.7kb的特异片段,经本科切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经Kpn Ⅰ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经本科切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了2个利用人类巨细胞病毒（HCMV）的启动子启动表达伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的真核表达质粒pCIDI和pcDDI，体外转染BHK－21细胞，用间接免疫荧光法检测，证实糖蛋白gD在细胞中得到表达。用表达质粒pCIDI和pcDDI作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体，结果其滴度为1：128－1：1512。初步证实，用gD基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答反应。     

伪狂犬病病毒上海株的gI基因的克隆和序列分析

参考Genebank发表的伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV)的gI糖蛋白基因序列，自行设计合成一对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，呈现一条约960bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，并进行序列测定，与PRV Rice株gI基因比较发现，核苷酸的同源性为94．7％，氨基酸的同源性为91．3％，证实为gI基因。     

伪狂犬病病毒Fa株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒pSKgDSB和pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残基水平上也有差异。     

伪狂犬病病毒Min—A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物，对PRVMin—A株进行了PCR扩增，扩增产物克隆于pGEM—TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明，目的片段包含1个1740bp的开放性阅读框(ORF)，编码由579个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明，PRVMin—A株与PRVEa株、SH株PE基因的核菩酸同源性分别为99．2％、98．7％；推导氨基酸的同源性分别为98．6％、97．2％。     

狂犬病病毒CTN株糖蛋白基因的克隆与序列分析

克隆分离自我国狂犬病病毒固定毒CTN株糖蛋白基因,分析它的主要功能位点表明它具有319位的糖基化位点和完整的抗原位点,说明其具有用作疫苗株的潜力。并与国内外疫苗株、我国的3株街毒株、CVS株和Mokola毒株进行了同源性分析,表明我国疫苗株和CVS株与我国的街毒株相距最远,而CTN株与我国的3株街毒株相距最近,同属一个分支。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定

合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。     

伪狂犬病病毒Ea株gM和gN基因的克隆与结构分析

gM和Ng是最近经经典免疫沉淀法确定的伪狂犬病病毒（PRV）第三对异源糖蛋白二聚体。根据PRV国外Ka株的核苷酸序列，设计两对分别包含gM和Ng完整编码的特异性引物，以PRV国内地方分离株（Ea株）的细胞感染物为模板，PCR扩增出大小约1．2kb和0．3kb的特异性片段。将扩增物克隆到杆状病毒转座载体pEastBacl中，酶切鉴定证实后进行序列测定。结果表明：Ea株gM、Ng基因分别编码394和98个氨基酸，与Ka株的同源性分别为98．4％和97．6％。DNATool和DNASIS软件对gM、Ng进行二级结构预测，发现gM存在8个潜在跨膜区和一个N－糖基化位点，是典型的能反复多次跨膜的Ⅲ型糖蛋白；gN具有N－端信号肽序列、C－端跨膜区和潜在0－糖基化位点，属Ⅰ型糖蛋白。上述结果为下一步深入研究gM、Ng的相互作用位点及二聚体的功能奠定了功能。     

伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增UL6全长基因,将PCR产物克隆于pMD18-T载体,并采用双脱氧终止法进行序列测定.序列分析显示UL6全长1 938 bp,可编码646个氨基酸.将该基因克隆到插入原核表达载体pET28a的6×His下游,获得原核表达质粒pET28a-UL6,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导在大肠埃希菌中成功表达获得分子质量约70 ku的融合表达蛋白6×His-UL6,Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生特异性反应.根据测定的序列,设计一对能扩增UL6基因完整编码区的引物,PCR扩增UL6基因并将其插入真核表达载体pEGFP-C2中EGFP基因的3'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL6,转染Hela细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染48 h,融合蛋白EGFP-UL6主要定位在胞浆,为进一步研究伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的结构和功能奠定了基础.     

伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析

根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）的基因序列,在ＰＲＶｇＥ基因阅读框外的上、下分别设计一对引物Ｐ１和Ｐ２,在引物的 ５’端分别加上 ＫｐｎＩ和 ＥｃｏＲＩ位点。以 ＰＲＶ Ｆａ株的 ＤＮＡ为模板成功地扩增得到一条长的 １．７ｋｂ的片段,经酶切鉴定,初步确定为ｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物经ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ消化后与同样酶切的ＰＵＣ１８质粒连接、转化,得到了明显大于载体的重组质粒ＰＰｇＥ。重组质粒ＰＰｇＥ经酶切鉴定确定为含有ＰＲＶ 的 ｇＥ基因,测序ＰｐｇＥ得到完整的ｇＥ基因片段,并与４株不同来源的毒株进行了比较分析。在对 ＰＲＶ Ｆａ（来自福建）、Ｒｉｃｅ（来自俄国）、ＴＮＬ（来自台湾）、Ｅａ（来自武汉）、ＳＨ（来自上海）的ｇＥ同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达９７％,这一定程度上也体现ｇＥ基因组的保守性。分析还表明Ｆａ与ＴＮＬ同源。同时９９％的高同源性也显示 Ｆａ、Ｅａ、ＳＨ可能是同一毒株。本实验认为 ｇＥ序列在 １０４０－ １４１０碱基的高同源性区域作为ＰＣＲ检测或核酸探针是非常有用的。     

伪狂犬病病毒冀A株TK基因的克隆及序列分析

为了分析比较伪狂犬病病毒(PRV)冀A株TK基因与GenBank中收录的国内外其他PRV毒株TK基因核苷酸及氨基酸序列的同源性,以伪狂犬病病毒冀A株的基因组为模板,PCR扩增了其胸腺激酶(TK)基因,并对其进行了克隆和测序.结果表明,TK基因的开放阅读框(ORF)和所比较的各株的核苷酸和氨基酸同源性都在99%以上.核苷酸序列中发现在起始密码子的上游有3段GC框样的序列,在终止密码子中发现多聚腺苷加尾信号AATAAA;在氨基酸序列中发现有疱疹病毒TK基因的保守序列R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-.     

伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析

从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。     

猪伪狂犬病病毒HP-SY2022株的分离鉴定

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒株的特点,本研究对沈阳某养殖场疑似感染PRV的组织病料进行PCR鉴定、病毒分离和纯化、gD、gE基因序列测定及分析、动物回归实验。结果显示：分离株能在ST细胞中产生典型的细胞病变,且PCR显示为PRV阳性;通过gD、gE基因进行序列分析发现,分离株与2011年后分离的PRV变异株位于同一进化分支;氨基酸位点分析发现分离株与PRV变异株具有相同的变异模式。进一步研究其致病性,将纯化后的病毒液接种PRV抗体阴性21日龄健康仔猪,感染仔猪出现典型的PR症状,如呼吸困难、转圈、流涎和划水动作,且在试验期内仔猪全部发病(5/5),其中4头死亡(4/5)。综上,本研究成功分离到一株PRV变异株,将其命名为HP-SY2022。这一研究为丰富我国PRV分子流行病学及后续的免疫防控提供了参考。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。