乙烯利诱导橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建

为解析乙烯利刺激巴西橡胶树橡胶增产的分子机制,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)成功构建了乙烯利刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库。经蓝、白斑筛选,共得到了118个阳性克隆。菌落PCR分析结果表明,92%左右的阳性克隆含有大小200～500bp的插入片段。随机选取25个克隆进行了测序,并用基因检索工具(Genbank)对获得的EST进行了Blastx分析,结果表明,5个EST属于无任何序列线索的未知序列,6个属于未知功能的推测蛋白基因,2个属于未知功能的蛋白基因,3个与已知功能基因具有较高的同源性。应用半定量PCR技术,对编号203片段进行的表达分析结果表明,该片段为乙烯利诱导特异表达基因,在乙烯利处理后24h范围内随处理时间的增加而表达量增强,叶片中没有检测到该基因的表达。     

巴西橡胶树胶乳表达ABC转运蛋白HbGCN1的克隆与表达研究

橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢,它是影响橡胶产量的首要因素。ABC转运蛋白(ATP Binding Cassette transporter,ABC transporter)是一类与植物次生代谢密切相关的蛋白大家族。筛选已构建的茉莉酸诱导橡胶树胶乳消减文库,并克隆了1个GCN(general control non-repressible)亚族ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,命名为HbGCN1。该基因开放阅读框共1 815 bp,编码605个氨基酸残基。表达分析表明:HbGCN1主要在橡胶树树皮及胶乳中表达,且在乙烯、茉莉酸或伤害诱导下上调表达,推测其可能与橡胶生物合成相关。原核表达该基因,为进一步的研究奠定基础。     

大豆疫霉根腐病菌诱导下SSH文库构建及初步分析

大豆疫霉根腐病是危害大豆生产的毁灭性病害之一,研究利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)成功构建了疫霉菌诱导的大豆抗病品种绥农10差异表达的cDNA消减文库,从文库中共筛选到2 067个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在100～800 bp之间,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对,获得有功能的EST375个,分析表明这些EST功能涉及大豆的抑制病原菌生长、细胞自身保护、信号传导、系统获得抗性、蛋白质合成、呼吸作用等.     

大豆花叶病毒诱导的野生大豆抑制差减文库构建及初步分析

以野生大豆Bian0526为试验材料,通过抑制性差减杂交技术(SSH)构建了大豆花叶病毒(SMV)诱导的cDNA 差减文库.在文库中共筛选到15343个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在500～800 bp之间.利用BLAST 在GenBank文库中进行序列相似性比对,获得有功能的EST 200个.对有功能注释的...     

玉米温敏型核雄性不育基因差异表达分析

以玉米温敏型核雄性不育近等位基因系琼42Qms(不育)和琼42(可育)为材料,通过跟踪解剖、显微观察确定了雄穗处于小花分化期为分离纯化mRNA的最佳时期,以琼42Qms的mRNA作检测样本(Tester)、琼42的mRNA作参照样本(Driver)进行抑制消减杂交,构建差异表达消减cDNA文库。从文库中选取10个cDNA片段作探针,与琼42Qms和琼42的小花分化期雄穗总RNA进行Northern杂交,获得一个仅在琼42Qms中特异表达的差异cDNA片段。以该片段作探针与琼42Qms小花分化期、抽穗成熟期的叶片和雄穗的总RNA进行Northern杂交,结果表明,该片段只在琼42Qms小花分化期的雄穗总RNA中有杂交信号,说明该片段是与核雄性不育相关的。      

应用抑制消减杂交技术 构建花生果皮差异表达文库

为构建花生果皮差异表达基因消减文库，分离花生果皮差异表达cDNA片段，本研究采用抑制消减杂交技术，以花生种仁cDNA为Driver，果皮cDNA为Tester，进行两次消减杂交和两次抑制性PCR，将第二次PCR产物与pGEM-T easy 载体相连，电击转化大肠杆菌，成功构建果皮差异表达cDNA文库。所长出菌落中89.2%为白色克隆。采用PCR法对重组子进行鉴定，发现其中单一扩增条带的克隆约占83.5%， 片段大小集中分布于250～750bp之间。     

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库 的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建cDNA文库的插入片段大小主要集中在100 bp~1000 bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。     

巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

橡胶树胶乳几丁质酶基因表达的品种差异

为了探讨不同品系橡胶树胶乳中几丁质酶基因在表达水平上的差异,利用聚合酶链式反应(PCR)技术,克隆得到长为935bp的橡胶树几丁质酶基因,对其进行序列测定。结果表明,该基因序列与EvertBokma(2001)发表的橡胶树几丁质酶基因序列一致。此外,从3个不同品系橡胶树胶乳中提取总RNA,以已克隆的基因为探针进行Northern狭线杂交。结果表明:3个不同排胶特性品系PR107,GT1,RRIM600的几丁质酶基因杂交信号强度表现为PR107GT1>RRIM600。     

利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库

以新采收荔枝果实的果皮为材料,利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库。结果表明,初级噬菌体文库滴度为1.1×10^6pfu/mL,重组率为88.1%,文库的插入片段平均长度约为850bp;扩增文库滴度为2.6×10^9pfu/mL。对2444个克隆进行了测序,获得表达序列标签（EST）2136条,平均测序长度562bp。这些EST拼接成为836个簇,含单一序列549条,重叠群287个。初级文库的冗余度为60.8%。     

茶树新梢cDNA文库的构建和ESTs测序成功率初步分析

报道了国内第一个茶树cDNA文库的构建及其EST测序成功率分析。以Trizol一步法从龙井43春茶新梢中提取总RNA,分离纯化富含Poly (A)的mRNA,LD-PCR反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建了龙井43新梢cDNA文库。以XL1-Blue为受体菌测定原始文库的滴度为6.8×10⁵ pfu/ml,总克隆数为3.5×10⁵个,重组率为98.05%,扩增后文库总滴度为7.2×10⁹ pfu/ml。对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定,表明插入片段大多分布在0.5-2.0 kb之间,绝大部分在1.0-1.5 kb左右。文库质量鉴定结果表明,构建的茶树新梢cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。对4320个克隆的序列测定表明,获得有用序列2963个,测序成功率为68.5%,剔除短序列后,首批共获得1687个茶树ESTs。     

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

cDNA Cloning and Sequence Analysis of Rice Sbe1 and Sbe3 Genes

Two starch-branching enzyme (SBE) in rice, is known to be a key enzyme in amylopectin biosynthesis. The cDNA of two SBE(starch-branching enzyme) genes Sbe1 and Sbc3 encoding SBE Ⅰand SBE Ⅲ(two major isoforms in rice) were cloned by an improved RT-PCR technique, from a template cDNA library derived from the total mRNAs extracted from the immature seeds of a japonica rice Wuyunjing 7. DNA sequence analysis showed that the size of the cloned Sbe1 and Sbe3 cDNAs were 2490 and 2481 bp long, respectively, including their entire coding sequences. Comparison analysis indicated that the nucleotide sequence of Sbe3 was the same as that of sbc3 (Genbank Accession No. D16201) as reported previously. There were only four base-pairs difference, which resulted in changes of two deduced amino acids between the cloned Sbel cDNA and the reported sbe1 (Genbank Accession No. D11082). The cloned Sbe1 and Sbe3 cDNAs make it possible to improve rice starch quality through genetic engineering     

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124 bp的5'端非编码区,337 bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框.该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SK2类脱水素蛋白.命名为H6DDHN1,与其它植物的SK2类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性.RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达.     

利用mRNA差别显示技术分离橡胶树死皮病相关cDNA

从中国热带农业科学院橡胶树早期预测试验地采集不同品系的橡胶树胶乳和树皮组织，分别提取纯化mRNA 合成cDNA第一链。通过4个简并锚定引物和10个随机引物进行PCR扩增，经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了至少4个差异DNA片段只在健康树中表达而在死皮树中没有出现，这4个差异DNA片段分别命名为Hb1(725bp),Hb2,Hb3,Hb4。对Hb1进行了分离，纯化，经Northern杂交证实，Hb1在健康树胶乳中表达活跃，而在死皮树胶乳中表达受到强烈抑制，表明Hb1是与死皮病相关的cDNA片段，进一步将Hb1片段进行回收和克隆，并进行DNA序列分析，序列在GenBank中进行BLAST分析未发现相关同源片段，死皮病相关cDNA片段的获得，将分离全长死皮病相关基因，搞清该基因表达调控的机理提供条件，进而为从分子水平上阐明死皮病的致病机理打下了基础。