旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库的构建及其步筛选

利用差减杂交（减法杂交，subtractive hybridization)技术，以旋毛虫新生幼虫（newborn larvae,NBL)的cDNA作为试验方（tester)，以肌幼虫＋成虫的cDNA作为驱动方（driver)，制备新生幼虫差减cDNA,利用T载体构建NBL差减cDNA文库，获克隆株90个，以试验方的差减cDNA第2次PCR产物＋未差减cDNA为试验方探针，以驱动方的差减cDNA第2次PCR产物＋未差减cDNA为驱动方探针，在NBL差减cDNA文库中初筛NBL的期特异性克隆，获初筛克隆24个。这些初筛斯异性克隆进一步用Southern blot确认鉴定，获直阳性期特异性克隆2个（NBL SSC1，NBL SSC2）.DNASIS以及Blaster的分析结果显示，这2个克隆为旋毛虫的2个新基因，其中NBL SSC1编码糖蛋白，NBL SSC2编码丝氨本蛋白酶，本试验为旋毛虫期特异性基困全长序列的调取，分析，鉴定以及强保护性抗原基因的筛选奠定了基础。     

旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10的表达及鉴定

根据旋毛虫新生幼虫期特异性基因pBK—CMV—N10序列设计引物，利用PCR技术将基因N10的信号肤去除后，用T／A法克隆到pMD-18T载体，转化至大肠杆菌NovaBlue，经鉴定及序列测定，结果显示成功克隆到N10基因。将重组质粒pMD-18T—N10进行酶切后连接到原核表述载体pET-28a中，重组质粒经鉴定后转化大肠杆菌BL21star（DES），用IPTG诱导表达出与理论相符的融合蛋白，相对分子质量为38700，诱导4h的表达量占菌体总蛋白量的15％。从N10重组蛋白提取可溶性融合蛋白，对其生物学特性初步鉴定结果表明，具有类似脱氧核糖核酸酶Ⅱ的活性。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库构建及其特异性基因的筛选与鉴定

构建旋毛虫新生幼虫cDNA文库并对旋毛虫新牛幼虫期特异件基因进行筛选与鉴定,筛选出期特异性的基因片段.用λZAPⅡExpress载体成功地构建了旋毛虫新生幼虫的cDNA文库,并用放射性同位素a-38P标记cDNA探针对筛选出的阳性克隆进行鉴定.所构建的cDNA文库容量为1.92×106,重组效率为98.6%,所有的克隆片段都在0.5～2.0 kb之间,筛选获得7个阳性克隆,其大小在1.4 kb左右;用放射性同位素a-32P标记cDNA探针后,与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫及成虫/新生幼虫cDNA文库质粒DNA进行Southern印迹杂交,结果与新生幼虫和成虫、新生幼虫cDNA文库质粒DNA有杂交而与成虫、肌幼虫cDNA文库质粒DNA不杂交.该基因是新生幼虫期所特有的cDNA片段.     

旋毛虫肌幼虫分泌性蛋白P49基因的克隆与表达

通过设计、合成引物，以旋毛虫RNA为模板，用RT—PCR法扩增出旋毛虫P49序列，并进行了序列测定。将P49基因亚克隆至表达载体pET—28b中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，作SDS—PAGE及Western blot分析。结果表明，PCR法扩增出P49序列，其大小约为960bp，将构建的重组质粒pGEM—P49进行序列测定表明其与Genbank中的P49序列具有高度的同源性。成功构建了重组表达载体pET—P49；SDS—PAGR及Western blot分析表明，表达产物分子量约为38kDa，约占菌体总蛋白的7％左右，且能被感染旋毛虫猪阳性血清所识别。     

旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达

应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选，对阳性克隆WN1序列进行生物信息学分析。结果表明，WN1 cDNA全长为474bp，含有1个354bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由117个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为13200，等电点为4．25，N-末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。GenBank数据库检索结果显示，此序列为一个新基因的全长cDNA。经PCR扩增WN1基因，将其克隆到原核表达载体pET28a，重组质粒经鉴定后，转化大肠杆菌BL21 star(DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白，与理论设计完全相符。     

旋毛虫新生幼虫对猪的免疫保护作用

给大白鼠经口感染７０００￣１００００条肌幼虫后７天剖杀，收集成虫。将７日龄成虫于１９９培养液中３７℃培养４８小时后过滤、离心收集新生幼虫。将冻融灭活的新生幼虫按不同数量与等体积弗氏完全佐剂乳化后按不同免疫程序经腹腔免疫猪。最后１次免疫后第７天攻击感染不同数量的肌幼虫。攻击感染后３５天剖杀全部试验猪，取膈肌脚消化检查，计算每克肌肉的荷虫量（ＬＰＧ）及免疫效力，同时观察免疫后及感染后的血清抗体消长变化     

旋毛虫3日龄成虫cDNA文库的免疫筛选

以旋毛虫感染猪血清为抗体探针 ,对旋毛虫 3日龄成虫 c DNA文库进行免疫筛选 ,将获得的阳性克隆进行测序 ,用分子生物学软件对所得 c DNA序列进行序列分析。结果从 4× 10 5个重组噬菌体中共获得 33个阳性克隆。序列分析结果显示 :共发现新 c DNA序列 16个 ,已知 c DNA序列 4个。其中阳性克隆 Zh8,9,10 ,12 ,13,14 ,2 0 ,2 6 ,2 8,2 9,36 ,5 4 ,6 8,70编码丝氨酸蛋白酶。通过免疫学筛选直接获得了具有免疫反应原性的阳性 c DNA克隆 ,为旋毛虫病诊断抗原及保护性抗原的筛选奠定了基础     

旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆与分析

以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫3日龄成虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序,用分子生物学软件对所得cDNA序列进行了分析。序列分析结果显示,阳性克隆Zh68cDNA全长为1372bp,含有1个1287bp的完整的开放阅读框架,编码由429个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为47．5ku,等电点为8．45。SMART分析表明,1～18位氨基酸为信号肽序列,37～277位氨基酸为典型的丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶类结构域,其中His88、Asp142、Ser233为催化中心的3个主要氨基酸残基,78～80位氨基酸为N-糖基化位点（NCS）,另外还有6个保守的Cys形成二硫键。BLASTn同源性分析表明,与其他生物丝氨酸蛋白酶的基因序列无明显的同源性,为1个新的cDNA分子。BLASTp蛋白质同源性分析表明,与丝氨酸蛋白酶的同源性为30％左右。Southern—blot杂交表明,此基因在旋毛虫基因组中属于多基因家族,具有基因多态性。cDNA的PCR结果表明,此基因在旋毛虫肌幼虫、新生幼虫及成虫期均有表达。     

旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定

采用RT-PCR和免疫荧光染色技术,分别检测T668基因mRNA及蛋白在旋毛虫不同发育时期中的时空表达情况。RT-PCR结果显示,该基因从旋毛虫新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加,T668基因mRNA逐渐减少,在感染后11～14 d T668基因的转录趋于停止。免疫荧光染色结果表明,在感染后1d,旋毛虫虫体即有T668蛋白表达;感染后6～13d,T668蛋白分泌到肿大的肌细胞核上;14～20d,肿大的肌细胞核上基本观察不到T668蛋白,但整个虫体仍有很强的蛋白表达。这提示在旋毛虫的寄生过程中,T668基因的转录及表达呈一定的时空特点,这可能对旋毛虫包囊形成有着重要作用。     

旋毛虫T668基因真核表达载体的构建及其在BHK细胞中的表达

利用RT-PCR技术从中国河南猪旋毛虫(国际标准虫种编号为ISS534)新生幼虫得到T668基因,并克隆入pEGFP-N1真核表达载体中构建重组质粒,该重组质粒在脂质体介导下转染BHK细胞。EGFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,Western blotting鉴定,细胞裂解液样品中有1条约77 000的条带,可被绿色荧光抗体及猪感染旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,表明成功构建T668-pEGFP-N1真核表达质粒,并在BHK细胞融合表达,表达产物具有抗原性。     

旋毛虫G10-7基因在大肠杆菌中的高效表达

旋毛虫新生幼虫期特异性 G10 - 7基因从 PBK- CMV- G10 - 7重组质粒中亚克隆到 p ET- 2 8b( )原核表达载体上 ,成功地构建了重组表达质粒 p ET- 2 8b- G10 - 7。将其转化到大肠杆菌 DE3感受态细胞中 ,经 IPTG诱导表达 ,其细菌裂解物经 SDS- PAGE电泳可检测到相对分子质量约为 34 0 0 0的目的蛋白带 ,且随诱导时间的延长蛋白表达量逐渐增加 ,诱导 4h达到峰值 ,薄层扫描结果显示 ,目的蛋白占菌体总蛋白的 6 1.7%。Western- blotting检测显示 ,此蛋白可被感染旋毛虫家猪阳性血清所识别 ,表明该蛋白具有良好的抗原性。     

猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登录的猪旋毛虫49kuES抗原基因序列设计了1对引物，用SDS裂解液配合蛋白酶K方法从猪旋毛虫不同发育时期（成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫）虫体中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增49kuES抗原基因，将目的基因定向克隆入pMD18-T载体，转化大肠埃希氏菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行单、双酶切鉴定，阳性质粒的测序结果表明，成功克隆了猪旋毛虫不同发育时期虫体49kuES抗原基因。序列分析结果显示：49kuES抗原基因大小为948bp，基因的保守性很强，序列同源性比较高，不同发育时期之间的差异很小。     

旋毛虫新生幼虫p46 000抗原基因的克隆及序列分析

应用旋毛虫感染猪血清，对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行了免疫筛选。对阳性克隆pBK-cMV-WN10的序列分析结果表明。cDNA全长为1352bp。含有1个1218bp的完整的开放阅读框架(ORF)，编码的多肽由406个氨基酸残基组成，其相对分子质量理论推导值为45900，等电点为5．43，N末端的信号肽及糖基化位点(NCS)表明其可能为分泌性糖蛋白，氨基酸序列19～156与158～295为重复区域，相似性为74％．C末端有1个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域，但旋毛虫p46000抗原与其他线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白结构有很大差异，可能已经失去半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的功能。PCR结果显示。从旋毛虫新生幼虫、肌幼虫、3日龄成虫和5日龄成虫cDNA中均扩增出此基因，表明此基因在旋毛虫各个时期均有表达。