猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5'非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SY13R GreenⅠ荧光定量RT-PC R方法.试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著.与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×10(2)病毒基因组拷贝数.利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交又免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具.     

实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒

根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒(NDV)核苷酸序列,设计针对中、强毒力NDVF基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR(RRT-PCR)检测中、强毒力NDVRNA的方法。该方法能从含有NDVⅠ系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9(基因Ⅸ型)、     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

应用实时荧光定量TaqMan RT-PCR检测口蹄疫病毒

按照口蹄疫病毒(FMDV)聚合酶3D基因序列,设计合成了引物和探针,经各反应务件的优化,建立了实时荧光定量RT-PcR技术,对细胞培养物、水泡液、水泡皮及分泌物、血液中的FMDV进行了特异性检测和敏感性试验。结果,用300nmol／L的引物浓度和200nmol／L探针浓度,获得的CT值较小,而△Rn最大;可检测到相当于9．1TCID50的病毒RNA;与VSV和其他水泡性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0．984;组内和组间试验重复性的变异系数(CV)分别为5．4％和6．7％;与常规RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据GenBank公布的猪瘟病毒基因组5′非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2×102病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。     

SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法快速鉴定新城疫病毒毒力

为快速鉴定不同新城疫病毒株(NDV)毒力,我们以NDV F蛋白裂解位点附近的基因序列自行设计1对引物,对不同毒力NDV毒株进行荧光RT-PCR扩增,根据其扩增效率及扩增产物熔解温度(Tm)值大小进行NDV毒株毒力的鉴定,建立了能区分NDV强弱毒株的SYBR GreenI荧光RT-PCR方法;同时将其与鸡胚平均致死时间(MDT)测定和F蛋白裂解位点序列分析结果进行比较。结果发现:建立的SYBR Green I荧光RT-PCR方法只需4 h即可判定结果,NDV强弱毒株扩增产物Tm值为(83±0.5)℃且有2个峰值,阴性对照Tm值为(81±0.5)℃且只有1个峰值;对NDV强毒株的扩增效率即Ct值在11~20之间,NDV弱毒株Ct值在25~30之间,阴性对照Ct值在30以上,Ct值在20~25之间为强弱毒株混合物。该方法检测结果与MDT测定和F蛋白裂解位点分析结果一致。应用SYBR Green I模式荧光RT-PCR方法与普通RT-PCR方法和鸡胚接种鉴定方法分别对80份临床组织样品进行检测,强毒株的检出率均为53.75%(43/80),而弱毒株的检出率相应为31.25%(25/80)、27.50%(22/80)和35.00%(28/80),检出符合率达89.3%以上。这些结果表明建立的SYBR Green I荧光RT-PCR方法具有特异、准确、快速等特点,可用于临床病料样本NDV毒株的毒力鉴定。     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。     

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。     

猪瘟病毒的实时荧光RT-PCR检测

应用实时荧光RT-PCR方法对12份猪瘟可疑病料进行了检测,结果有9份为阳性,阳性率为75%（9/12）,并对这12份病料进行猪瘟直接免疫荧光抗体试验,结果与猪瘟实时荧光RT-PCR检测结果基本一致,结果证明,应用实时荧光RT-PCR方法诊断临床中的猪瘟病例可行,并具有快速、准确、敏感的特点。     

新城疫病毒通用型实时RT-PCR检测方法的建立与应用

采用TaqMan方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法。结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5~10-7之间;建立的方法与常见禽类病毒无交叉反应,特异性良好;在检测人工感染肉鸡的脏器组织、咽喉、泄殖腔拭子中病毒的灵敏度同鸡胚分离试验基本一致;弱毒疫苗免疫鸡群在免疫后14 d,应用本方法不能从咽喉、泄殖腔拭子中检测到病毒;临床样品检测表明,该方法不仅可以检出中强毒力新城疫毒株,也可检出缓发型野毒株和疫苗毒株。     

荧光RT-PCR检测活禽和禽产品中新城疫病毒中强毒株的研究

本研究中，采用TaqMan方法，根据新城疫病毒F基因核苷酸序列，设计合成多对引物，在上游引物和下游引物之间设计多条探针，通过对引物、探针的筛选，反应条件的选择和优化，建立了检测活禽和禽产品中中强毒力新城疫病毒的荧光RT-PCR方法。经对10株倍比稀释的中强毒力新城疫病毒的尿囊液进行检测后，表明所建立的荧光RT-PCR方法的检测极限在10^-5～10^-7”之间，略低于鸡胚病毒分离方法（10^-8～10^-9）；对收集到的所有新城疫病毒株和常见禽类病毒（包括禽流感病毒H5、H9亚型、IBDV、IBV、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒）进行检测，结果表明建立的方法不能检出其他的常见禽类病毒，特异性良好。进一步用建立的荧光RT-PCR检测人工感染SPF肉鸡的组织脏器、咽喉及泄殖腔拭子及临床样品中的中强毒力的新城疫病毒，并同鸡胚分离结果比较，结果表明荧光RT-PCR的敏感性同鸡胚分离试验基本一致。由于荧光RT-PCR方法快速，从处理样品开始到出结果只需不到4小时，而且检测样品量大，这就充分显示了其快速、敏感、特异的优势。在强调口岸快速通关的今天，该方法的建立无疑为活禽或禽产品的快速检验检疫提供了有效的手段。     

新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

经对部分发表在NCBI里的新城疫病毒序列进行比对,在其F基因上找到1段相对保守序列,根据保守序列设计1对引物和1条TaqMan探针,以新城疫Ⅰ系疫苗株(Mukteswar株)作为标准品,通过系列条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了一种灵敏度高、特异性强和重复性好的荧光RT-PCR检测新城疫病毒的方法.该方法能检测最低初始病毒浓度为102.2 ELD50/mL,且在108.2～102.2 ELD50/mL内Ct值与病毒浓度的对数值(lgELD50/mi)呈很好的线性关系,R2达到0.997 5;该方法对禽流感、禽痘病毒和禽大肠杆菌等禽病病原核酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;临床样品检测中荧光RT-PCR与鸡胚分毒的符合率、诊断灵敏度和诊断特异性分别为98.5％,50.0％和98.4％.因此,荧光RT-PCR检测方法的建立为新城疫病毒检测提供了一种快速有效的方法,为新城疫病毒的研究奠定了一定的基础.     

Quantitative real-time PCR assays for the concurrent diagnosis of infectious laryngotracheitis virus,Newcastle disease virus and avian metapneumovirus in poultry

Newcastle disease (ND), infectious laryngotracheitis (ILT) and avian metapneumovirus (aMPV) can be similar making it critical to quickly differentiate them. Herein, we adapted pre-existing molecular-based diagnostic assays for NDV and ILTV, and developed new assays for aMPV A and B, for use under synchronized thermocycling conditions. All assays performed equivalently with linearity over a 5 log₁₀ dynamic range, a reproducible (R² > 0.99) limit of detection of ≥ 10 target copies, and amplification efficiencies between 86.8%–98.2%. Using biological specimens for NDV and ILTV showed 100% specificity. Identical amplification conditions will simplify procedures for detection in diagnostic laboratories.     

新城疫病毒的流行和毒力演变趋势

文章回顾了20世纪80年代以来新城疫在世界各地流行的概况,介绍了新城疫病毒感染宿主不断扩大的趋势,探讨了新城疫毒力演变的分子机制,结合我国不同时期新城疫流行的基因型变化,对新城疫的演变规律做了具体的阐述.     

Sensitive, semi-nested RT-PCR amplification of fusion gene sequences for the rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus

A rapid, sensitive and specific semi-nested RT-PCR was developed to detect and differentiate virulent and avirulent strains of Newcastle disease virus (NDV). For a total of 67 NDV strains, the results obtained from the semi-nested RT-PCR were consistent with those from nucleotide sequence analysis, plaque forming assays, mean death time (MDT) measurements and intracerebral pathogenicity index (ICPI). Furthermore, 13 class I NDV strains can be characterized by the semi-nested RT-PCR approach, which was feasible by the conventional methods. The detection limit for the semi-nested RT-PCR was two plaque forming units (PFU) both for NDV strain F48E9 in allantoic fluid and for isolate APMV1/ch/ChinaND4031 in oral or cloacal swabs. In conclusion, this semi-nested RT-PCR method offers a new assay for the rapid detection and differentiation of NDVs.     

基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。     

1株鸡新城疫强毒株的分离鉴定及致病性

从山东省一发病率、死亡率高的肉鸡群中分离到1株病毒,经HA、HI试验和动物回归试验确定所分离的毒株为新城疫病毒,命名为新城疫LVCX株。按常规方法测得LVCX株的MDT、ICPI和IVPI分别为47.4h、1.975和2.85,鸡胚半数致死量LD50为10-9.8。F基因分析表明分离株LVCX为基因Ⅶ型,其多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,表明LVCX株为新城疫病毒强毒株。该毒株F基因核苷酸同源性与近几年分离的基因Ⅶ型鸡源毒株同源性在93.5%～98.3%之间;与经典强毒株F48E9和Lasota株的核苷酸和氨基酸同源性分别为85.8%、91.3%和83.3%、88.4%;且与近几年分离的几株鹅源、鸭源核苷酸同源性也较高,在95.2%～96.5%之间。     

鸭源新城疫病毒强毒株对鸭的致病性

对鸭源新城疫病毒（NDV）强毒株JSD0812对鸭的致病性进行了研究。结果显示,对于15日龄雏鸭,JSD0812株病毒尿囊液的半数致死剂量（LD50）为101mL。15,30,45,60。110日龄鸭肌肉注射感染试验结果表明,所有日龄鸭感染JSD0812株后均可发病,但死亡率随日龄的增长而下降,110日龄鸭感染后未见死亡。鸭感染后可经咽喉和/或泄殖腔短期排毒,感染鸭组织器官中病毒分离率较低。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.