用毕赤酵母表达李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及表达产物抗血清的制备与研究

用RT-PCR的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白(CP)基因,然后将其连接到pGEM-T载体上,得到pGEM-T-PNRSV重组载体,然后将其克隆到真核表达载体pPIC9K上,转化毕赤酵母GS115菌株后,在甲醇的诱导下表达外壳蛋白,表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot分析,结果表明该病毒的CP基因在毕赤酵母中得到了高效表达,回收表达蛋白并免疫家兔,获得PNRSV特异性抗血清共计40mL,经过间接酶联免疫吸附法测定其效价为3.2×104,本研究利用基因克隆的方法来制备PNRSV抗血清,完全避免了用该病毒的繁殖来制备抗血清而导致该病毒扩散蔓延的风险。     

李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP基因的克隆、原核表达及其抗血清制备

本研究通过RT-PCR技术获得了包含李属坏死环斑病毒怀柔分离物CP蛋白基因的DNA片段,构建了针对pET29a载体的两种表达质粒;〖JP2〗转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达了带不同融合肽段的PNRSV1（25 ku）〖JP〗和PNRSV2（29 ku）融合蛋白。经过Ni NTA亲和柱与SDS PAGE分离纯化,获得大量表达融合蛋白,并免疫家兔制备了融合表达蛋白的特异性抗体。间接ELISA测定其效价分别为8×103和3.2×104。     

李属坏死环斑病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

本实验用RT—PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的印基因，并将其连接到表达载体pET-22b（＋）上，得到重组质粒pET—PNRSVCP，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明，印基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为29．0kDa。将该融合蛋白免疫兔子，获得PNRSV特异性抗血清。酶联法（ELISA）测定的效价为1／1024。为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。     

瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 根据已报道的瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法从感病甜瓜中扩增得到长度为753 bp的CP基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组载体pGexCP,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了CCYV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,当CP蛋白浓度为2.5 μg/mL时,血清效价高达5.12×10⁵。Western blot分析表明制备的抗体检测CCYV侵染的甜瓜叶片得到特异性的条带,表明该抗体的特异性较好。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甜瓜病样的检测。本试验为CCYV的快速检测提供了重要的研究材料。     

白草花叶病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 将白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus,PenMV)的外壳蛋白(CP)基因连接到表达载体pET22b (+)上,获得重组子pET-PCP。SDS-PAGE和Western blotting分析表明,经IPTG诱导后,含pET-PCP的大肠杆菌BL21(DE3) pLys产生分子量为36 kDa的融合蛋白。以Ni²⁺亲和层析柱纯化该蛋白,并以其为抗原免疫德国大白兔制备了特异性较强的抗血清。微量免疫沉淀法测其效价为1:1 024,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1:8 192。该血清可替代常规病毒粒子所制备的抗血清,用于检测PenMV。     

表达的hrmA蛋白质具有诱导水稻细胞产生防卫反应的活性

 将丁香假单胞菌hrmA基因构建到原核表达载体pET 29中,得到重组载体pET hrmA。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得了以包含体形式存在的融合蛋白。复性的融合蛋白能诱导水稻悬浮细胞的活性氧迸发,处理20min后达到峰值。Northern杂交结果表明hrmA蛋白能显著地诱导PBZ1基因在水稻悬浮细胞中表达,在所观察的时间内PBZ1基因表达丰度随处理时间延长而增加,用hrmA处理水稻植株,诱导了PAL基因的表达。实验结果表明hrmA融合蛋白具有激活水稻细胞防卫反应的活性。     

百合斑驳病毒外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及其应用

为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清。结果显示:LMoVCP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1∶51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致。     

小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗体制备及应用

 小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病是近年来我国小麦生产中的一种重要病毒病害,急需研发快速精准的检测技术用于预测预报和病毒-介体相互作用的研究。本研究应用Gateway重组技术构建了外壳蛋白基因(Coat protein, CP)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导获得CP基因原核表达蛋白。以重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备得到了相应的抗体,Western blot检测表明制备的抗体能与CP重组蛋白、感病小麦和带毒叶蝉特异性结合,说明获得的抗体特异性高。用获得的抗体进行免疫荧光标记,观察到病毒分布在介体叶蝉的前中肠和中中肠部位,为WDV的预测预报和介体条沙叶蝉传毒机制的研究奠定了基础。     

柑橘黄龙病菌亚洲种菌毛装配蛋白基因(PAP)序列分析、原核表达及抗血清制备

菌毛装配蛋白(Flp pilus assembly protein, PAP)是一种分泌蛋白,参与细菌菌毛的组装,表达量高。本研究以感染柑橘黄龙病的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,用其菌毛装配蛋白基因(PAP)的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段,序列分析表明海南琼海柑橘黄龙病菌PAP基因与柑橘黄龙病菌亚洲种(GenBank登录号:CP001677.5)PAP基因序列一致。功能预测表明它含有两个与分泌功能相关的CpaC和Secretin结构域。PCR产物通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-PAP。将pET32a-PAP载体转化BL21(DE3)大肠杆菌,经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni~(2+)-NTA层析柱纯化,并作为抗原腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶1 000的多克隆抗血清。Western blot分析表明,PAP多克隆抗血清特异性强;以田间样品总蛋白做抗原时,能特异性检测染病样品。本研究为PAP蛋白功能研究和开发柑橘黄龙病菌的蛋白检测产品提供研究基础。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 采用RT-PCR方法克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒辽宁分离物(Cucumber green mottle mosaic virus Liaoning isolate, CGMMV-LN)的cp基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b (+)上, 将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b (+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和W estern blot分析表明, cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达, 融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔, 制备了CGMMV特异性抗血清, 抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20 000。     

Systems of designation of pathotypes of plant pathogens12

A variety of systems of designation has evolved to name pathotypes of plant pathogens. The systems were evaluated to determine those best suited for particular purposes. Virulence and avirulence/virulence formulae of pathotypes have advantage over the use of consecutive numbers or letters given in chronological order of pathotype discovery. As soon as pathotype information exceeds a certain level of complexity, mathematical codes are most advantageous, in particular two codes, octal notation and coded triplets. A more universal adoption of the most appropriate codes is recommended to ease communication and comparisons of results.     

Investigation of the Mode of Action of Nematode Neuropeptides

The neuropeptide AF2 has a complex set of actions on the dorsal muscle strip of Ascaris suum, including a potentiation of the acetylcholine-stimulated muscle contraction. Caffeine at 100 μm and 5 mm inhibited this potentiation, as did 100 μm theophylline in two out of six studies. The cyclic-AMP-potentiating compounds IBMX, dibutyryl cAMP and forskolin had no effect on the AF2-induced potentiation of the acetylcholine-stimulated muscle contraction. These preliminary data suggest that the potentiating action of AF2 is not mediated by a cAMP pathway.     

福寿螺配偶个体大小选择性初步观察

通过野外观察与实验研究,掌握了福寿螺的婚配体制及其配偶选择性规律。福寿螺与多数低等动物一样,其婚配属于乱交制,无固定配偶;雌螺对与其交配的雄螺个体大小没有选择性,而雄螺对雌螺的个体大小有选择性,倾向于与较大个的雌螺交配。     

Localization of metabolic sites of action of herbicides

Time- and concentration-course studies were conducted to determine the effect of thirteen herbicides on photosynthesis, respiration, RNA synthesis, protein synthesis, and lipid synthesis using isolated single leaf cells. Each herbicide was from a different chemical class. Appropriate ¹⁴C-substrates and product purification procedures were used for each process prior to liquid scintillation counting. The most sensitive metabolic site of inhibition was photosynthesis for atrazine, bromacil, dichlobenil, monuron, and paraquat; RNA synthesis for dalapon and dinoseb; protein synthesis for chlorpropham; and lipid synthesis for CDAA, chloramben, 2,4-D, EPTC, and trifluralin. However, with several herbicides, one or more process was almost as sensitive as the one mentioned above. All herbicides inhibited more than one process, and the most sensitive site of inhibition may not be the same process that was inhibited the greatest at the maximum concentration and maximum exposure time used. Therefore, a concept of metabolic sites of action, rather than a primary site of action, appears to be more meaningful for herbicides.     

Effects of timing and method of application of Penicillium oxalicum on efficacy and duration of control of Fusarium wilt of tomato

The effects of timing and method of application of Penicillium oxalicum on the control of fusarium wilt of tomato were investigated. Application of P. oxalicum to tomato seedlings in seedbeds reduced disease caused by Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici in a growth chamber by 45–49% and in glasshouse experiments by 22–69%. Disease suppression was maintained for 60–100 days after inoculation with the pathogen in the glasshouse. No disease reduction was observed in tomato plants where P. oxalicum was applied to seeds. Treatment with P. oxalicum did not affect the population of F. oxysporum f.sp. lycopersici in the rhizosphere.     

厚朴病虫害种类的初步调查

采用标准地法和线路调查法,对湖北恩施市新塘乡双河厚朴基地的厚朴病虫害进行了系统调查,记录主要虫害13种,其中叶部害虫9种,枝干害虫2种,根部害虫2种。厚朴主要病害5种。藤壶蚧、厚朴枝角叶蜂和厚朴新丽斑蚜为湖北省首次报道,小绿叶蝉为厚朴新寄主记录种。同时记录了藤壶蚧的天敌6种,其中寄生小蜂2种,瓢虫4种;厚朴新丽斑蚜的天敌昆虫8种。对藤壶蚧、厚朴枝角叶蜂和厚朴苗木根腐病等重要病虫害的发生规律进行了初步调查,同时提出了防治建议。     

青稞种子带菌检测及杀菌剂消毒处理效果

为了研究青稞种子外部和内部携带真菌情况,比较不同杀菌剂对青稞种子的带菌消毒效果和对幼苗生长的影响,为青稞种子播前包衣处理和种传真菌病害防控提供依据,采用离体平皿法对云南迪庆‘云青1号’、‘云青2号’和‘短白青稞’3个主栽品种进行带菌检测,并对种子进行拌种或浸种处理测定6种杀菌剂对种子消毒效果,分析杀菌剂对种子发芽和幼苗生长的影响。结果表明:供试青稞种子表面携带的优势菌群为青霉(Penicilliumspp.)、镰刀菌(Fusariumspp.);种子内部寄藏的真菌主要为镰刀菌、核腔菌(Pyrenophoraspp.)、附球菌(Epicoccumspp.)、丝核菌(Rhizoctoniaspp.)、链格孢(Alternariaspp.)和木霉(Trichoderma spp.)。青稞不同品种的种子表面及内部携带的真菌种类差异较大。致病性测定表明,镰刀菌对种子萌发和幼苗生长影响最大,后期出现幼苗坏死现象。45%咪鲜胺EW、75%百菌清WP、50%福美双WP对青稞种子携带真菌均有显著抑制作用和消毒效果,50%福美双WP消毒效果最优,达100%;45%咪鲜胺EW、75%百菌清WP、50%福美双WP处理对青稞种子发芽和幼苗生长均无显著影响。     

棉花黄萎病菌致病型的AFLP分析

 选用41个棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)代表菌系,在温室条件下,对4个棉花品种鄂荆1号(感)、中棉所12(耐)、文-5(抗)和唐棉2号(抗)进行致病性测定,结果可将供试菌系分为落叶型与非落叶型2类。选取8对AFLP引物PCR扩增的结果中,统计带型稳定、清晰且有多态性的条带,共169条作系统聚类分析,将上述菌系分为2大类,第一类为非落叶型菌系,包括10个非落叶型菌系和1个过渡菌系;第二类为30个落叶型菌系。根据聚类分析建立树状图,发现菌系与地理来源存在一定的相关性,而依据菌系致病力强弱分类则相关关系不大。选用25对EcoRⅠ和MseⅠ引物组合,对供试的41个V.dahliae进行AFLP扩增,筛选到2对引物E64(GACTGCGTACCAATTCGAC)、M53(GATGAGTCCTGAGTAACCG)和E49(GACTGCGTACCAATTCCAG)、M65(GAT-GAGTCCTGAGTAAGAG),能分别扩增出433bp和110bp2条仅为V.dahliae非落叶型菌系独有的特异片段,可将落叶型与非落叶型菌系分开,这2条特异片段被命名为EM₄₃₃和EM₁₁₀。     

黑麦草属DNA条形码鉴定技术研究

以毒麦、田毒麦、多花黑麦草、多年生黑麦草、硬直黑麦草、高羊茅与狗牙根等禾本科的7种植物为材料,拟采用 DNA 测序、特异性位点比对、种间遗传距离测定、建立系统树等分析候选 DNA 条形码 psbA-trnH 鉴别黑麦草属常见植物的能力。实验结果表明,以 psbA-trnH 为 DNA 条形码时,建立的系统发育树能较好区分毒麦和田毒麦与其他几种植物。psbA-trnH 序列可以作为黑麦草属植物的潜在条形码。