不同毒力溶藻弧菌脂多糖的多态性研究

提取了10株不同毒力的溶藻弧菌脂多糖,其中HN08811、HN08155、HN08813、HN08335、HN07006为毒力菌株,HN08805、HN08307、HN08156、HN08801和TG06003为非毒力菌株.分别取10μg进行SDS-PAGE电泳.结果表明,不同毒力溶藻孤菌脂多糖的电泳条带存在较丰富的多态性,在类脂质A区段(分离胶的上半部分),不同菌株间图谱呈片状堆积,多态性难以分辨;在抗原多糖O-特异性侧链条带区段(分离胶的下半部分),除HN07006外,毒力菌株的条带清晰,数目在7～9条之间,所有非毒力菌株产生细而密集的可辨条带.本文为一类遗传型的溶藻弧菌毒力菌株的快速鉴别提供了一种新的分子分型指标,也为溶藻弧菌的血清型分型提供了直接理论依据.     

cbpD基因对溶藻弧菌毒力及相关生物学特性的影响

为研究几丁质结合蛋白(Chitin-binding protein D,CbpD)对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力和相关生物学特性的影响,通过同源重组技术构建溶藻弧菌ZJ-T的cbpD基因缺失突变株ZJ-T-ΔcbpD,比较突变株与野生株对斑马鱼(Danio rerio)的毒性,以及毒力相关生理过程,包括生长能力、运动性、胞外蛋白酶分泌活性、溶血活性、抗生素敏感性、生物膜形成、过氧化氢(H₂O₂)和铜离子(Cu²⁺)抗性以及铁离子(Fe³⁺)吸收能力的差异。研究发现,cbpD缺失后,溶藻弧菌对斑马鱼的毒力显著减弱,且细菌游动能力、涌动能力和胞外蛋白酶活性均降低,突变株对Cu²⁺的抗性提高;cbpD的突变不影响溶藻弧菌在富营养培养基中的生长、生物膜的形成、溶血活性、对大部分抗生素敏感性、对H₂O₂的抗性和Fe³⁺的获取能力。结果表明,cbpD可能通过正调控溶藻弧菌的运动能力和胞外蛋白酶分泌...     

利用mini-Tn10转座子文库筛选鳗弧菌M3表型发生变化的基因

为了寻找影响鳗弧菌(Vibrio anguillarum)表型变化的基因,本研究使用转座子mini-Tn10 (pLOF/Kana)构建了鳗弧菌M3突变株文库,筛选影响表型变化的菌株及相关基因,证明这些表型变化的突变子与毒力存在一定的相关性。对M3突变文库的1152突变子进行筛选,获得泳动能力改变的突变子1个(编号为6G_1),酪蛋白酶活性发生改变的突变子3个(编号为5A_11、7B_12和7E_12),明胶酶活性发生改变的突变子1个(编号为7H_1),以及菌膜形成能力发生显著变化的突变子3个(编号为5E_2、6A_2和6E_12)。对转座子插入位点进一步分析显示,一个磷酸二酯酶相关基因突变引起泳动能力增强(P<0.05),leuD、rseB和thiQ突变引起酪蛋白酶活性显著减弱(P<0.05),potD突变引起明胶蛋白酶活性显著减弱(P<0.05),leuO、ilvH和grpB的突变引起菌膜形成能力明显减弱(P<0.05)。对这些表型变化的突变子进行毒力感染,发现野生型M3是6G_1突变子的半数致死剂量(Lethal dose 50%,LD50)的2.04倍,该突变子毒力相对增强。5A_11、7B_12和7E_12的突变子LD50分别为野生型M3的2.96、3.25和3.36倍。7H_1的LD50是野生型M3的1.25倍,5E_2、6A_2和6E_12的LD50分别为野生型M3的3.34、4.08和1.84倍,这些突变子毒力相对减弱。本研究结果为进一步阐明鳗弧菌的发病机制提供了理论基础。     

引发杂色鲍苗掉板死亡的溶藻弧菌分离鉴定及毒力分析

跟踪观察了广东汕尾鲍鱼养殖场的培苗过程,并从变白病鲍苗中分离到1株优势菌(1号菌株).2次不同时间、不同地点的回归感染实验均证明其可引发鲍苗死亡掉板,API条带分析表明其为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);胞外毒力因子分析揭示该菌株可分泌蛋白酶、脂肪酶、明胶酶以及拥有明显的溶血能力.结果证明了溶藻弧菌可引发我国南方杂色鲍苗掉板死亡.     

基于一种新基因的溶藻弧菌毒力菌株检测方法的建立

根据溶藻弧菌毒力菌株HN08155的1个新的特异性基因序列设计了1对特异性引物SDRHf和SDRHr,扩增产物大小为217 bp;以此引物对为基础成功建立了与HN08155具有相似遗传型的溶藻弧菌毒力菌株PCR快速分子检测试剂盒.该试剂盒具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,为海产品及水体中致病性溶藻弧菌的检测提供了一种有效方法.     

一株致病性溶藻弧菌的多重耐药与毒力基因分子分析

从发病的凡纳滨对虾中分离并经鉴定得到一株溶藻弧菌(命名为:V_A-76),通过对虾回感实验和药物敏感性实验分别对V_A-76菌株的耐药表型和致病能力进行了研究,并运用PCR方法检测了该菌的毒力相关基因、整合子和耐药基因的携带情况。对虾感染实验结果表明,溶藻弧菌V_A-76能够导致凡纳滨对虾发病死亡。经PCR检测发现,该菌携带8种毒力相关基因:tdh、tlh、tox S、collagenase、fla A、omp W、asp A和fur。药敏结果显示,V_A-76对环丙沙星、氯霉素、链霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、复方新诺明和利福平7种药物表现出较高的耐药水平,且该菌包含1类整合子、4类超级整合子SXT和1型插入序列共同区(ISCR1)。此外,该菌携带arr-2、dfr A27、str A、str B、floR、cat和qnrv C耐药相关基因。从上述研究结果可知,菌株V_A-76既具有一定的感染能力,同时对多种抗菌药物表现出较高的耐药水平,提示应对养殖源致病性弧菌的耐药性现状予以更多的关注。     

创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究

对用Sarkosyl法分离的创伤孤菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌的外膜蛋白进行了初步的比较分析.这4种弧菌外膜蛋白的SDS-PAGE和Western blotting的图谱有相似性亦有差异.SDS-PAGE显示,4种弧菌中除副溶血弧菌外均能分离到47、38 ku的外膜蛋白;创伤弧菌和溶藻弧菌存在4种共同的外膜蛋白,大...     

鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果

将鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）分别用0.3%福尔马林灭活,制备成鳗弧菌和溶藻弧菌2种单苗,并将2种菌等量配制成二联疫苗,单次腹腔注射免疫大菱鲆（Scophtalmus maximus）.通过检测免疫后替代途径补体活力、溶菌酶活力、抗体凝集效价的变化并分别进行攻毒实验比较疫苗的免疫效果.结果显示,3种疫苗对所测定的各免疫指标都有一定的促进作用,但二联疫苗后期效果低于2种单苗.二联疫苗对鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为83.52%和83.24%,而鳗弧菌单苗对鳗弧菌攻毒、溶藻弧菌单苗对溶藻弧菌攻毒的免疫保护率分别为80.37%和74.89%.可以认为2株菌具有制备二联疫苗的可能性.[中国水产科学,2006,13（3）：397-402]     

斜带石斑鱼溶藻弧菌病的研究

从患病的斜带石斑鱼肝和肾组织分离的两株病原菌,进行纯化培养、人工感染、VITEK-AMS-32自动微生物分析鉴定及药敏试验,经形态和生理生化测定,确定为溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。组织病理变化主要表现为鳃、肝和肾细胞变性、坏死,病变组织炎性细胞浸润,呈变质性炎症。     

梭子蟹溶藻弧菌病的初步研究

2005～2006年,昌邑池塘养殖梭子蟹发生被称为"牙膏病"的疾病,并导致大量死亡。发病时间主要在7～9月份的高水温期,病蟹典型症状是肌肉白浊、无弹性、呈不透明的乳白色。从病蟹的肌肉、肠道、胃、眼球、肝胰腺均分离到单一形态的微生物,经生理生化鉴定为溶藻弧菌。人工感染实验发现,其对健康梭子蟹具有致病性,出现与自然发病蟹相同的症状,并在人工感染病蟹中分离出同样性状的菌株,证实其为该病病原菌。     

溶藻弧菌外膜蛋白(Va-OMP)的免疫原性及免疫保护性

利用初步制备的溶藻弧菌外膜蛋白（outer membrane protein of Vibrio alginolyticus, Va-OMP）、溶藻弧菌蛋白分子量58 kD外膜蛋白（Va-OMP58）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, Va）灭活菌苗、溶藻弧菌脂多糖（lipopolysaccharides of Vibrio alginolyticus, Va-LPS）菌苗等进行主动保护性和被动保护性的实验比较,VaOMP、Va-OMP58免疫组小鼠免疫后用活菌攻击,免疫保护率为62.5%～86.7%,而Va-LPS组和Va灭活菌苗组的免疫保护率为50%～62.5%,对照组的免疫保护率仅为6.7%。用不同抗血清免疫小鼠,活菌攻击后,Va-OMP组存活率达到53.3%和66.7%,VaOMP58组次之,存活率为40%和50%,Va灭活菌组的存活率为33.3%和46.7%,对照组为13.3%。与对照组相比较,Va-OMP组差异较显著,保护效果较好。溶藻弧菌外膜蛋白和蛋白分子量58 kD外膜蛋白的保护性效果高于溶藻弧菌灭活菌苗和溶藻弧菌脂多糖的保护性效果,证明外膜蛋白（outer membrane protein, OMP）具有较强的免疫原性。迟发性超敏反应试验也证明,OMP能诱发变态反应,间接证明OMP具有较强的引起细胞介导免疫反应的能力。因此实验证明,Va-OMP、Va-OMP⁵⁸是能在小鼠产生体液免疫和细胞介导免疫的保护性抗原。     

暗纹东方鲀非01霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测

在对养殖暗纹东方病害调查中,从呈典型症状病鱼腹腔和肠道粘液中分离到2株（J-1和H-3）菌株,经生化特性和血清型鉴定为非01群霍乱弧菌(Non-01 Vibrio cholerae)。注射、创伤和浸泡3种方式进行人工感染试验表现出较强的致病性,出现症状与自然发病鱼相同。为进一步确认分离菌株的分类地位,使用P1、P2引物,以非01群霍乱弧菌N92001菌株和01群霍乱弧菌N16961菌株为对照,对分离菌株进行PCR扩增,得到451bp的DNA片段。根据现有霍乱弧菌肠毒素ctxA基因序列设计引物P3,P4,以N16961菌株为阳性对照,PCR扩增结果均得到大小为400 bp的DNA片段。在对H-3菌株的扩增片段进行纯化、克隆和测序,得到407bp序列,该菌株与N16961菌株中肠毒素ctxA基因序列的完全一致,证实该片段源于ctxA基因。进一步说明从暗纹东方体内分离到的J-1和H-3菌株具有霍乱肠毒素ctxA,有一定的致病力。     

复方中草药及其与抗生素联用对斜带石斑鱼溶藻弧菌病的治疗效果

通过药物体外抑菌效果及对斜带石斑鱼抗病力影响的研究,筛选有效治疗斜带石斑鱼溶藻弧菌病复方中草药与中西药联用配方。用诃子、白芍、甘草比例分别为0.9∶1.3∶0.9、1.2∶0.9∶1.0和1∶1∶1的复方中草药对溶藻弧菌进行体外抑菌实验;将质量分数为2.2%的复方中草药与中西药联用添加到基础饲料中设为实验组,研究中西药对斜带石斑鱼溶藻弧菌病治疗效果。复方中草药实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为投喂饲料中添加不同比例诃子、白芍、甘草,中西药联用实验组Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分别为投喂饲料中添加不同比例诃子、白芍、甘草、恩诺沙星。结果显示,复方中草药配方二药物质量浓度200 mg/mL,为最佳配方。40 d病鱼死亡数量比较结果为对照组Ⅱ对照组Ⅳ对照组Ⅲ实验组Ⅲ实验组Ⅱ实验组Ⅰ实验组Ⅴ实验组Ⅵ实验组Ⅳ对照组Ⅰ。实验组Ⅰ投喂饲料加诃子、白芍、甘草比例为0.9∶1.3∶0.9的复方中草药,实验组Ⅳ配方为诃子、白芍、甘草、恩诺沙星比例为0.9∶1.3∶0.9∶1.3,分别为治疗斜带石斑鱼溶藻弧菌病效果最好的复方中草药和中西药联用配方。研究表明,中西药联用复方药效强于复方中草药,均能较好治疗斜带石斑鱼溶藻弧菌病。     

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

溶藻弧菌是中国南部水产养殖业中弧菌病的最主要病原菌,数量居海洋类弧菌之首,其快速检测具有重要意义。以溶藻弧菌国内标准株ATCC17749基因组DNA为模板,PCR扩增出外膜蛋白OmpK基因,将其克隆入表达载体pET-28a中,获得重组质粒pET-28a-OmpK,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列开放读码框正确且与已发表的OmpK结构编码序列完全一致。将重组质粒pET-28a-OmpK转化大肠杆菌BL21 pLys E,高效表达重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠所得的高免血清能外膜蛋白OmpK特异性结合,表明体外表达的重组蛋白OmpK具有良好的免疫原性和反应原性。利用该抗溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的抗血清建立了间接ELISA检测方法,检测灵敏度为10⁴ CFU/mL,能特异性检测出溶藻弧菌,与其他菌株无交叉反应。     

溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护研究

为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物.     

溶藻弧菌诱导对三疣梭子蟹血淋巴非特异性免疫水平的影响

以平均体质量为(162±26)g雌性三疣梭子蟹为试验对象,注射组从游泳足第一关节基膜注射200 μL浓度为2.4×107 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液,对照组注射等量无菌生理盐水.各组在注射0、24、48、72、96h后随机取9只三疣梭子蟹,从游泳足基膜部位抽取血淋巴,测定血淋巴的血细胞总数、大颗粒细胞比例、血清蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、一氧化氮和诱导型一氧化氮合成酶等非特异性免疫指标.结果表明,遭受低剂量的溶藻弧菌侵袭后,三疣梭子蟹血细胞总数迅速降低(P＜0.05),与对照组相比降低36％,而大颗粒细胞比例则先上升(P＜0.05),72 h后恢复至正常水平;血清蛋白含量则无明显变化;血清中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性也迅速增加,并分别在24、72 h达到峰值(P＜0.01,P＜0.05),在96h后两种酶的活性均恢复至对照组水平;血清中一氧化氮含量及诱导型一氧化氮合成酶活性则稳步增加,并在96 h达到峰值(P＜0.01).研究证实低剂量的溶藻弧菌能刺激三疣梭子蟹调动血细胞、酸、碱性磷酸酶、一氧化氮合成酶系统进行免疫防御,但是各非特异性免疫指标大多具有明显的时间效应,响应速度有较大差异.     

温度对尼罗罗非鱼无乳链球菌毒力的影响

为了解温度对鱼源无乳链球菌毒力的影响机制,本实验研究了温度对无乳链球菌毒力相关参数(生长、粘附、入侵、毒力基因表达以及对罗非鱼致死率)的影响。结果发现,不同培养温度下(25~40 ℃)无乳链球菌的生长速度不同,37 ℃为其最适生长温度,25 ℃时生长速度最慢;25~34 ℃内无乳链球菌粘附在惰性基质上的菌体对应的吸光值(OD_590nm)之间无显著差异(P>0.05),37 ℃时显著增加,40 ℃时又急剧下降;罗非鱼在人工感染无乳链球菌后各时间点(6、12、24和48 h),鱼体脑组织中菌量随注射菌体培养温度的增加呈先上升后下降的趋势,且与不同培养温度下的无乳链球菌对罗非鱼的致死率呈正相关;无乳链球菌毒力基因的表达也与培养温度相关,hly和cfb基因的表达量随菌体培养温度的升高先增加后降低,分别在34和37 ℃处达到峰值,不同培养温度下无乳链球菌sip基因表达的变化幅度较小,而scpB基因的表达则随培养温度增加而下降;无乳链球菌对罗非鱼的致死率随其培养温度的升高呈先升高后降低趋势,低温(25和28 ℃)培养条件下的菌体对罗非鱼致死率较低(<20%),37 ℃时致死率最高66.67%±6.67%。以上结果表明温度参与无乳链球菌生长、粘附、转移、入侵和部分毒力基因表达的调控,它们共同影响无乳链球菌对罗非鱼的毒力。     

灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响

为探究灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响,用1×10~6、1×10~7、1×10~8个/mL 3个浓度的灿烂弧菌刺激厚壳贻贝,探讨弧菌刺激后厚壳贻贝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)等免疫指标和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的变化情况。结果显示,灿烂弧菌刺激48 h后,厚壳贻贝足、鳃、消化腺等组织中仅消化腺的NOS活性较对照组有显著升高,且酶活性随初始细菌浓度的升高而升高,故选用消化腺来测定灿烂弧菌刺激后72 h内的免疫指标和消化酶活性的变化。灿烂弧菌刺激后,48 h内NOS活性较对照组均显著升高。NO含量较对照组均显著升高,与NOS显现相同变化趋势。SOD活性在各浓度灿烂弧菌刺激下较对照组均显著升高,而MAD含量在实验组中含量显著低于对照组。淀粉酶活性在实验组中显著低于对照组,总体呈现先下降后升高的趋势。蛋白酶活性在各实验组中均呈现先升高后下降的趋势。研究表明,灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和蛋白酶活性的升高有诱导作用,但对蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚壳贻贝对灿烂弧菌的免疫应答机制,为进一步研究灿烂弧菌和厚壳贻贝相互作用机制以及厚壳贻贝免疫机制奠定了基础。     

Vibrio mediterranei 117-T6引发的坛紫菜黄斑病的初步研究

以一株黄斑病致病菌Vibrio mediterranei 117-T6感染坛紫菜的自由丝状体,研究了环境因子对该菌株生长的影响及其最易感条件,检测了该条件下V. mediterranei 117-T6引发的坛紫菜丝状体的抗氧化酶(SOD、POD)活性以及藻胆蛋白、叶绿素a(Chl. a)、可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量等生理指标的变化。结果显示,V. mediterranei117-T6的最优生长条件为30°C、pH 7.0、盐度20,最易感条件为30°C、pH 6.0、盐度20。在易感条件下培养12 h后,感染组坛紫菜丝状体的SOD和POD的活性,藻胆蛋白、可溶性蛋白以及游离Pro含量等指标均显著高于对照组;MDA含量峰值出现在6 h,显著高于对照组;在24 h后,感染组的Chl. a含量达到峰值,亦显著高于对照组。研究表明,短期内弧菌感染虽然可以刺激坛紫菜丝状体产生胁迫应激反应,但是随着感染时间的延长,致病菌感染引发的藻体内活性氧及渗透压胁迫加剧,最终导致紫菜死亡。高温和酸化等不良的环境会加剧V. mediterranei 117-T6引发的坛紫菜黄斑病的恶...     

利用cDNA-AFLP技术研究副溶血弧菌感染下拟穴青蟹的基因差异表达

研究以实验室分离自汕头牛田洋青蟹养殖区的副溶血弧菌感染的健康拟穴青蟹,利用cDNA-AFLP技术分析感染前后拟穴青蟹肝脏组织基因的转录表达差异,最终获得了23个差异片段,其中20个片段成功测序。BLAST分析表明,序列与已知功能基因具有同源性的有6个,其中5个经real-time PCR重新验证为上调表达,主要涉及参与能量代谢的精氨酸激酶(arginine kinase)和甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase),以及参与转运过程的精氨酰tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase),同时,还有直接参与免疫防御反应的凝乳状蛋白酶(chymotrypsin-like proteinase)。另外,8个差异片段与已知基因或序列无同源性。