农杆菌介导的马铃薯试管薯遗转化体系的优化及反义class Ⅰ patatin基因的导入

用两个马铃薯栽培品种“鄂马铃薯3号”和“甘农薯2号”的试管薯为供体材料，建立了一种农杆菌介导的简单、快速和高效的遗传转化系统。在含有75mg／L卡那霉素的选择培养基上，2～3周可产生抗性芽，4～5周获得完整的转基因植株。筛选出了试管薯遗传转化的优化条件，特别是在再生培养基中加入2mg／L玉米素，两个品种的转化频率分别高达45．5％和43．9％。周期短(4～5周)、一步培养和转化频率高，使该转化体系能够广泛用于马铃薯转基因的研究。用含有反义class Ⅰ patatin基因的表达载体pBSAP转化两个品种，共获得120株卡那霉素抗性植株。PCR、PCR-Southern和Northern杂交分析证明，此反义基因已整合到马铃薯基因组中并在转基因植株中正常转录。反义基因的表达导致部分转基因植株的试管结薯株率和单株结薯数降低。结果表明，该class Ⅰ patatin基因可能参与了块茎形成的调控。     

不同品种马铃薯试管薯诱导体系的优化

利用5种培养基和3种培养方法对马铃薯的大西洋、陇薯3号和甘农2号品种进行了试管薯的诱导。结果表明：8%的蔗糖浓度是大西洋和陇薯3号试管薯诱导的最佳糖浓度;5mg/L 6-BA的添加可有效提高结薯率和增加块茎直径;在含8%蔗糖的培养基上,琼脂的添加与否对试管薯的诱导率没有影响;在不含蔗糖的MS培养基中,300μmol/L 山梨醇+20mmol/L NH4NO3+20mmol/L KNO3的添加对试管薯的形成和发育不利;3种培养方法中,液体培养法的试管薯诱导效率最好。     

白糖对马铃薯试管薯诱导的影响

本研究以马铃薯栽培品种"荷兰15号"、"克新1号"为试验材料,研究白糖和基因型对马铃薯试管薯诱导的影响。结果表明,添加50~110 g/L白糖有利于脱毒苗壮苗、促进试管薯结薯、提高试管薯诱导率。MS固体基本培养基+100 g/L白糖,温度(17×1)℃、光照强度2 000 Lx、光照时间10 h/d诱导效果最好,初始结薯期最短为9.67 d,诱导率78.47%、单株结薯1.21个/株、单薯重77.1 mg/个、大中薯率70.01%。研究结果表明:用食用白糖替代蔗糖,能提高试管薯诱导率和大中薯率,缩短试管薯结薯周期,降低规模化生产试管薯成本。     

马铃薯试管薯生产技术研究

利用液体MS+蔗糖8％+5 mg/L BA+不同激素水平(500 mg/L CCC、0.05 mg/L PP333、0.01 mg/L PP333、0.5 mg/L PP333)培养基作为诱导培养基,对马铃薯早熟品种“费乌瑞它”和中晚熟品种“同薯20号”进行试管薯诱导,研究其实用化的生产技术.结果表明,添加0.5 mg/L PP333、0.1 mg/L PP333的诱导培养基分别可作为“同薯20号”和“费乌瑞它”的试管薯生产的诱导培养基.     

马铃薯不同品种块茎再生体系的建立和优化

为建立最佳的马铃薯块茎再生体系,本研究分别以‘夏坡蒂’、‘费乌瑞它’以及‘克新1号’的试管薯和大田薯为试验材料,采用控制变量法对马铃薯块茎再生体系进行筛选,以获得其培养基最佳激素浓度配比,并对不同来源马铃薯块茎不定芽分化率进行对比。结果表明,‘夏坡蒂’、‘费乌瑞它’和‘克新1号’愈伤组织的最佳诱导培养基组合分别为MS+1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+1 mg/L ZT、MS+1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+2 mg/L ZT和MS+1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+2 mg/L ZT。‘夏坡蒂’与‘费乌瑞它’的不定芽最佳分化培养基组合为MS+1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+2 mg/L ZT;‘克新1号’的最佳分化培养基组合为MS+1 mg/L IAA+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+2 mg/L ZT。试管薯的块茎不定芽分化率显著高于大田薯。     

几种植物生长调节剂对马铃薯脱毒试管苗生长的影响

采用正交实验设计,研究了5种植物生长调节剂（2,4-D、6-BA、NAA、KT、GA）对两种马铃薯脱毒试管苗（青薯2号和青薯6号）生长的影响。结果表明：适合青薯2号试管苗生长的最佳培养基为2,4-DO．5mg／L＋6-BA1．0mg／L＋KT0．9mg／L＋GA6．5mg／L;适合青薯6号试管苗生长的最佳培养基为2,4-D2．5mg／L＋6-BA2．0mg／L＋KT0．1mg／L＋GAl0．0mg／L．为快速、低成本培养健壮试管苗打下了基础。     

激素配比对马铃薯试管薯诱导和块茎形成的影响

本研究以马铃薯栽培种费乌瑞它为材料,研究了激素配比与基因型对马铃薯诱导的影响。结果表明,随着IAA和NAA浓度的增加,费乌瑞它的试管薯诱导率和单薯重呈波浪式递减,6-BA+IAA处理的诱导率高于6-BA+NAA处理,6-BA+NAA处理的单薯重高于6-BA+IAA,添加6-BA+NAA有利于改变组培苗腋芽处茎尖的生长方向,诱导试管薯的形成;添加6-BA+IAA有利于试管薯块茎膨大、提高试管薯鲜重,通过主成分分析,试管薯诱导率和单薯重对激素诱导效果的贡献率分别为60.26%、34.78%。综合比较5个品种在L5和L7两种激素配比处理时的试管薯诱导效果,L5处理比L7处理的费乌瑞它、黑美人、庄薯3号和大西洋4个品种试管薯诱导率高出5.83~11.11个百分点,以试管薯诱导率为第一主分量,筛选出最适宜试管薯诱导的培养基为:MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.4 mg/L+30 g/L白糖+4.8 g/L。本研究明确了筛选最优激素配比的主要指标,探明了NAA和IAA两种激素对试管薯产量和质量的影响效果,为规模化生产试管薯培养基的优化提供了理论参考。     

马铃薯试管薯诱导体系研究

为了加快马铃薯试管薯的繁殖速度,通过优化马铃薯试管薯诱导的影响因素,建立适合马铃薯试管薯诱导体系。结果表明：适合马铃薯试管薯诱导的培养基为MS+IBA 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L+香豆素10 mg/L+蔗糖10%+活性炭0.2%,培养条件为暗培养,培养温度为20℃,可使结薯率达94.25%,单粒薯重达0.128 g,优质薯率达100%,为试管薯的工厂化生产奠定技术基础。     

马铃薯试管苗快繁培养基研究

针对脱毒马铃薯试管苗大规模生产继代扩繁中的问题,进行了MS培养基的改良试验.结果表明:固体支持物卡拉胶和琼脂之间无显著差异,低廉的卡拉胶可替代琼脂; MS培养基中NPK浓度对不同品种试管苗的适应存在差异,费乌瑞它较适应高NPK浓度的MS培养基,而中薯3号较适应常规含量的MS培养基;0.5mg/LNAA对2个品种试管苗效果不好.     

3种生长调节剂对马铃薯试管苗生长的影响

为提高试管苗品质,优化马铃薯脱毒继代培养,以延薯4号脱毒苗为试验材料,选用6-BA（0.5、1.0、1.5mg/L）、水杨酸（0.2、0.4、0.6mg/L）和油菜素内酯（0.01、0.10、1.00mg/L）处理试管苗,以不添加生长调节剂为对照,研究3种生长调节剂对马铃薯试管苗生长形态特征、叶绿素含量、根活力、移栽后幼苗成活率及结薯特性的影响,结果显示,3种生长调节剂均能在一定程度上增加株高、茎粗、鲜重、平均根长、根条数和叶片数,6-BA、水杨酸和油菜素内酯分别在1.0mg/L、0.4mg/L和1mg/L处理时促进效果较好,叶绿素含量、根活力以及移栽后幼苗成活率和结薯特性均较好,且在水杨酸浓度为0.4mg/L时,试管苗生长最好,移栽后成活率最高,结薯特性较好,是最适壮苗培养基。     

马铃薯耐热无性系离体筛选的初步研究

为了获得耐热性较高的马铃薯品种,本研究以马铃薯试管苗的愈伤组织为供试材料,采用羟脯氨酸(HYP)和热胁迫相结合的方法来进行马铃薯耐热无性系的离体筛选研究.研究结果表明,MS+1.5～3.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA的培养基均能够诱导全部供试马铃薯茎段产生愈伤组织,说明细胞分裂素6-BA对愈伤组织的形成有着非常重要的作用;同时确定了马铃薯愈伤组织耐羟脯氨酸筛选的适宜浓度为0.2～0.4 mg/mL.MS+1.0～5.0mg/L BA+0.1 mg/LNAA+5 mg/LGA的分化培养基能够诱导愈伤组织进行植株再生,但分化率较低,只有8%～25%.结果表明不同浓度的分化培养基均能诱导马铃薯愈伤组织分化成苗,本实验还筛选出热胁迫的适宜条件为42℃24 h,且经过羟脯氨酸与高温胁迫结合多次筛选获得了两个耐热无性系NKY1和NKY2.初步表明本筛选方法可以用于马岭铃薯耐热无性系的筛选.     

马铃薯未授粉子房离体培养诱导双单体植株初探

以MS培养基为基本培养基,添加不同种类和浓度的生长调节剂,离体培养8个马铃薯普通栽培种（2n=4x=48）品种的未授粉子房,获得了青薯168和青薯7号的双单体小植株。花蕾4℃下预处理24~72 h的愈伤组织诱导率（51.24%~57.08%）比未预处理（9.35%）的明显提高。对青薯168和青薯7号而言,最佳培养基分别为MS+2-4-D 2.0 mg/L+ZT 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L和1/2MS+GA3 0.5 mg/L+2-4-D 0.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+BAP 2.0 mg/L+ ZT 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂7 g/L。品种对愈伤组织分化形成小植株的影响比培养基的影响要大。     

黄瓜子叶节不定芽的诱导及对甘露糖耐性的研究

为了进一步优化黄瓜组织培养体系,将非杭生素筛选标记用于黄瓜遗传转化中,以黄瓜新津研四号、绿地黄瓜和新津优1号为材料,研究黄瓜3个基因型在两种培养基中诱导不定芽的能力以及3个基因型子叶节对甘露糖的耐性。结果表明,黄瓜3个基因型不定芽诱导能力相似,L4(MS+lmg/L6-BA+0.5mg/L ABA+4mg/LKT)培养基诱导黄瓜不定芽的效果好于LS(MS+2mg/L6-BA +0.025mg/L IAA+4mg/L KT)培养基;当用甘露糖作为黄瓜子叶节遗传转化杭性筛选剂时,适宜筛选浓度为5mg/L。     

表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯的获得

用农杆菌介导法将bar基因导入甘薯主栽品种徐薯18的胚性悬浮细胞中,获得了抗除草剂的转基因植株.农杆菌菌株EHA105携带的双元载体pCAMBIA3300上含有bar基因.来自于徐薯18胚性悬浮细胞的直径为0.7～1.3 min的280个胚性细胞团用于遗传转化.共培养3 d后,首先在含有2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb的液体MS培养基中培养1周,然后将胚性细胞团转移到添加2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb 和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上进行选择培养.选择8周后,将获得的37个PPT抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100mg/L carb和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上,其中的34个愈伤组织诱导得到体细胞胚并发芽形成小植株,共获得了164株拟转基因植株.PCR分析表明,其中的123株为转基因植株.Southern blot和Northern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中并正确表达.除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性.     

大量元素不同浓度组合对试管马铃薯结薯的影响

大量元素在MS培养基中用量最大,如果改变其浓度组合能得到更多、更大的试管薯,这对试管薯的生产是很有利的。本研究以马铃薯品系97-1-1脱毒试管苗为材料,MS＋5mg/L B9＋8％蔗糖＋0.4 mg/L IBA为基本培养基,通过改变诱导试管薯培养基中的大量元素浓度倍数,N、P、K浓度倍数,N、P、K分别的浓度（正交设计）,以研究诱导试管薯培养基大量元素浓度的最优组合。结果表明,N、P、K整体加倍至2倍,大量元素其他成分不改变为经济效益的最优组合;不加P素,大量元素其他成分浓度不改变为试管薯数量的最优组合;不加N素,P、K加至2倍,大量元素其他成分不改变为试管薯直径的最优组合。     

糖浓度及光照条件对试管薯诱导的影响

通过一步法进行试管薯的诱导,不更换培养基,研究试管苗培养阶段光照时间及糖浓度对会-2、云薯201、中薯三号及威芋三号4个马铃薯品种试管薯诱导的影响.结果表明:增加培养基糖浓度会提前试管薯形成期;不同品种需要不同的适宜试管薯诱导的光照时间和糖浓度;适当的光照时间有利于诱导较大的试管薯;相对早熟品种而言,晚熟品种诱导阶段需要更多的光照时间;不同品种需要做培养环境的筛选和品种结薯性评价,以筛选出最佳的诱导条件.     

不同激素配比对马铃薯组培苗壮苗生根的影响

以马铃薯北方002为材料,目前北方002组培苗在实验室适合的培养基为MS+0.1mg/LIBA+0.5mg/L6-BA和MS+0.1 mg/L IBA+1.5 mg/L 6-BA,在此基础上加入不同浓度的GA3,以期筛选出更为适合的培养基。探究了不同激素配比对马铃薯组培苗壮苗生根的影响,为提高新品种试管苗品质及脱毒种薯规模化生产提供技术基础。     

马铃薯晋薯16号愈伤组织再生体系的建立

为建立马铃薯品种晋薯16号组织再生体系,以晋薯16号无菌苗为材料,对外植体类型、外植体表面消毒试剂浓度和根的诱导条件进行筛选,同时优化了愈伤组织诱导和分化的最佳植物激素组合及浓度。结果表明:愈伤组织诱导的最佳外植体为茎段;2%的次氯酸钠消毒效果较好;根的诱导使用含50g/L蔗糖的MS培养基较好;愈伤组织诱导培养基以MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L为佳;愈伤组织分化培养基以MS+6-BA 1.5mg/L+GA3 2.0mg/L+ZT 1.0mg/L为佳。     

马铃薯脱毒微型薯组培快繁技术研究

研究首先从5种培养基中筛选出最合适的培养基,即N2培养基,具有制备方便、成本低的优点,适宜于规模化应用;进一步研究了N2培养基对试管苗继代培养以及对不同品种试管苗生长的影响;研究了马铃薯微型原种组培快繁的关键因素,结果表明：马铃薯脱毒微型薯组培快繁的最佳培养基是N2：N1+吲哚乙酸（IAA,5 mg/1000ml）和奈乙酸（NAA,3 mg/1000ml）。     

农杆菌介导柱型苹果“鲁加6号”遗传转化体系的建立

本研究以柱型苹果"鲁加6号"试管苗叶片外植体为转化材料,以卡那霉素抗性基凶为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的柱型苹果"鲁加6号"苹果的遗传转化体系.研究结果表明:在MS+6-BA 4.0mg,/L+NAA 0.05 mg/L培养基上,叶片不定芽分化阶段Km的选择压力为20 mg/L,不定芽生根阶段Km的选择压力为15 mg/L,脱菌培养阶段头孢霉素的适宜浓度为300 mg/L.在农杆菌介导的遗传转化过程中,外植体经过36 h预培养,侵染10 min,共培养48 h时,有利于提高遗传转化效率,获得的抗性愈伤组织和抗性芽数均最高.获得的Km抗性植株经PCR检测,扩增出特异条带,初步证明目的基因已整合到苹果基因组DNA中.