苜蓿假盘菌的生物学特性研究

摘要：本试验研究了温度、水分、pH值、光照、碳源、氮源以及无机盐对苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)宁夏菌株生物学特性的影响。结果表明,苜蓿假盘菌宁夏菌株在5～30 ℃、pH值4.0～10.0均可生长,最适温度为20～25 ℃,最适pH值为5.0～6.5,该菌随光照强度的增加生长受到抑制,能利用固体培养基上不同的碳源,对葡萄糖和麦芽糖的利用较好。除尿素抑制病菌的生长外,该菌能不同程度利用无机氮源和有机氮源,菌落直径和生长速率基本一致,差异不明显,但菌落数差别较大,无机氮源优于有机氮源。供试的4种盐溶液除KH2PO4没有菌生长外,其余3种生长量基本一致,但4种盐溶液下生长的菌落均不产生子囊盘。叶片表面的游离水及游离水保持的时间可影响孢子的萌发,且叶表游离水保持3 h以上,孢子才能萌发。     

苜蓿假盘菌分离方法及培养性状比较研究

采用离心稀释法和叶面弹射法分离苜蓿假盘菌,结果表明离心稀释法能够得到纯化的菌落,而叶面弹射法能弹射出单个或成对的孢子,但无法获得菌落。南疆菌株在4种培养基上的培养性状与北疆菌株存在显著差异,尤其体现在子囊盘大小指标上,南疆菌株为147.22～199.34μm,而北疆菌株为96.29～14.74μm,在形成菌落所需的时间、菌落颜色等方面也存在一定差异。研究表明V-8苜蓿汁培养基最有利于菌落生长和孢子成熟。     

苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征

从细胞角度揭示苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作机制。以两者亲和性互作系统为研究材料,利用透射电子显微镜技术研究了苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征。结果表明,病菌侵入寄主组织后,菌丝直接穿透寄主细胞壁进入寄主细胞形成胞内菌丝,以胞内生长并向相邻细胞扩展。病菌菌丝穿透寄主细胞壁时,菌丝中的液泡给予了较大的压力帮助其穿透。进入寄主细胞内的病菌菌丝,被内陷的寄主原生质膜包裹,菌丝与质膜始终是隔离的,寄主原生质膜和细胞壁之间沉积电子致密度深的物质。病菌菌丝不断地在寄主原生质膜区域扩展,伴随菌丝体在寄主细胞内的不断扩大,周围的原生质膜也相应扩大其面积,但始终将寄主原生质与菌丝体隔开,而脱离质膜的菌丝形成菌丝鞘包裹。随侵染程度的增加,未被穿透的寄主原生质膜区域逐步被降解。病菌侵染叶绿体等细胞器时,首先是菌丝鞘与叶绿体等细胞器膜相连,然后降解其基粒片层结构,被降解的细胞器组织沿菌丝和胞壁周围沉积。侵染后期,菌丝胞内和胞外扩展,但处在细胞降解物中的菌丝显示较厚的细胞壁,寄主细胞内充满了大量的黑色物质和结晶状的颗粒物。     

不同抗性苜蓿株系叶片感染假盘菌后酶活性的变化

采用活体整株接菌法研究苜蓿高抗褐斑病株系DR1111和高感株系DS10在假盘菌诱导不同时间(0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d、15d、20d)后叶片多胺氧化酶(PAO)、二胺氧化酶(DAO)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化。结果表明,接种假盘菌后高抗病株系和高感病株系的四种酶活性均有提高,接菌后20d内酶活性变化基本上呈先升高再降低的趋势,高抗株系的DAO活性显著高于高感株系(P<0.05),感病株系的SOD活性在第3~10d显著高于抗病株系(P<0.05);高抗株系的PAO和DAO活性峰值出现早于高感株系,而高抗株系的CAT活性峰值则晚于高感株系。     

苜蓿假盘菌ISSR反应体系优化及指纹图谱构建

以北京苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis (Lib.) Sacc.)菌株为试材,用ISSR-23引物[序列为(AC)8T]研究PCR反应体系的主要成分及退火温度对假盘菌ISSR扩增的影响,以期为苜蓿假盘菌的深入研究奠定基础。结果表明:Primer、Mg²⁺、Taq酶和dNTP浓度对扩增均有影响,以Primer影响最为明显;优化的反应体系为:20μL反应体系中含0.1 ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl₂、0.5μmol/L Primer、1U Taq DNA聚合酶、0.2 mmol/LdNTP,2μL 10×PCR Buffer和2.5%去离子甲酰胺;在此基础上,建立6个不同地理来源苜蓿假盘菌菌株的指纹图谱并分析其亲缘关系;对44条ISSR引物进行筛选,22条可产生清晰稳定的多态性条带,其中16条可将6个供试菌株完全分开,建立了苜蓿假盘菌指纹图谱;经聚类分析,在0.55遗传相似水平下,6个供试菌株分为两个遗传谱系,菌株的遗传谱系与其地理来源之间不表现相关性。     

苜蓿褐斑病对紫花苜蓿光合作用及草品质的影响

为确定褐斑病对紫花苜蓿光合作用和草品质的影响,以便确定此病的重要性,选取了发生该病不同严重度的植株,用LI-6400光合仪测定了5个光合作用指标,采集不同严重度的叶片和茎秆,分别测定了10个营养成分指标。结果表明:以健康无病植株为对照,随发病严重度的增加,紫花苜蓿叶片中粗灰分(Ash)、酸性洗涤纤维(ADF)含量分别增加19.94%、71.21%,与严重度的相关系数均为0.95;中性洗涤纤维(NDF)、钙(Ca)、单宁及总酚含量分别增加39.68%、136.42%、21.93%、50.55%,与严重度的相关系数分别为0.91、0.85、0.89、0.85;粗蛋白(CP)、钾(K)含量分别减少15.67%、29.91%,与严重度的相关系数分别为-0.99、-0.86;粗脂肪(EE)、磷(P)含量减少,与严重度相关性不显著;茎秆中Ash、NDF感病后含量下降,其他品质指标与叶片感病后变化趋势一致;胞间CO₂浓度(C_i)升高,与严重度相关性不显著;净光合速率(P_n)、蒸腾速率(E)分别下降93.27%、68.34%,与严重度的相关系数分别为-0.82、-0.86;气孔导度(G_s)与水分利用效率(WUE)亦呈下降趋势但差异不显著,与严重度相关性不显著;P含量与5个光合指标均无显著相关性;其他品质指标均与P_n、E有极显著或显著相关性。主成分分析表明:第一主成分可以代表80.94%不同严重度褐斑病苜蓿品质和光合作用的变异信息,主要有Ca、K、Ash、单宁、总酚、E、P_n、ADF、NDF、CP、C_i、EE、WUE、G_s等指标。表明褐斑病影响紫花苜蓿光合作用,进而影响草品质。     

苜蓿褐斑病接种方法研究

以苜蓿假盘菌为接种菌源,对3个不同抗性的苜蓿品种(即伊鲁瑰斯、沙湾和泾阳)采用3种活体整株接种方法,即接种盘倒扣接种法、活体病株覆盖接种法和孢子悬浮液喷雾接种法,进行比较,以筛选出稳定、可靠、操作简便、发病速度较快的接种方法.结果表明,病株覆盖接种和孢子悬浮液喷雾接种为较理想的接种方法,可以比较准确、快速的鉴定出品种及单株的抗病性,其中孢子悬浮液最佳缓冲液组成为:0.5%吐温-20 4.5%葡萄糖 9mg/L萘乙酸 1g/L菌落.     

苜蓿锈病寄主范围研究

通过室内和田间人工接种苜蓿锈病病原物,观察苜蓉病的寄主范围。研究表明,苜蓿锈病的寄主除苜蓿属的植物外,扁蓿豆属的扁蓿豆、三叶草属的白三叶草、野火球等均是该病原锈菌的夏孢子的寄主,大戟属的乳浆大戟是苜蓿锈菌的转主寄主。扁蓿豆、罢火球是国内外未见报道的新寄主,乳浆大戟是国内尚未见报道的转主寄主。     

苜蓿褐斑病气象因子预测模型研究

通过对北京地区苜蓿褐斑病的系统调查,结合历年该病发生的历史资料,在褐斑病发生流行规律的基础上,对影响该病流行的相关气象因子进行逐步回归分析,组建了北京地区苜蓿褐斑病流行的预测模型Y=-48.465+0.152X1+0.599X2-0.019X3,并对该模型的预测准确度进行了检验。     

抗褐斑病苜蓿RAPD多态性研究

运用RAPD技术,采用集群分离分析法对5个苜蓿品种进行抗褐斑病基因连锁的分子标记研究。结果表明,在160个随机引物中有107个有扩增产物,其中54个扩增出的产物的电泳图谱较稳定、清晰,再从中筛选出8个能够同时在3个以上苜蓿品种内的抗、感材料间显示多态性的随机引物,其RAPD标记的大小为600～1400bp。     

苜蓿褐斑病抗性与几种同工酶的关系

以苜蓿5个品种在褐斑病抗性上存在差异的抗、感单株为材料，研究了接种病菌后苜蓿褐斑病抗性与多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)及其酶活性的关系。研究结果表明，褐斑病侵染后，苜蓿抗病株系和感病株系叶片中PPO、POD和SOD同工酶谱带多少和强弱存在明显的差异，即大部分抗病株系PPO、POD和SOD酶活性高于感病株系，并有新的同工酶带出现。PPO、POD和SOD在苜蓿抗褐斑病上可能起到重要作用，其同工酶谱带和酶活性的差异有可能做为鉴定苜蓿抗褐斑病的一种同工酶标记。     

苜蓿褐斑病菌离体叶片接种方法及侵染途径观察

筛选比较了5种苜蓿褐斑病菌离体叶片接种技术,结果表明,逆向产孢培养技术是苜蓿褐斑病的理想接种方法。利用扫描电镜,对逆向产孢培养技术离体接种的苜蓿假盘菌（Pseudopeziza medicaginis）子囊孢子侵入途径观察发现：接种到叶片上的子囊孢子4 h后开始萌发产生芽管以直接侵入的方式侵入寄主表皮细胞,侵入前不形成附着胞等侵染结构,未观察到子囊孢子由气孔侵入。     

宁夏南部山区苜蓿褐斑病田间发生及流行动态

根据不同地带、田块和不同的刈割期,针对目前宁夏南部山区栽植的国外引进品种、地方品种进行了褐斑病Pseudopeziaz medicaginis田间发生及流行动态调查。结果表明,不同苜蓿Medicago sativa品种上褐斑病的发生程度不同,18个调查品种中,加拿大DY和耐寒苜蓿发病重,其次是美国杂花苜蓿、WL323、中首1号,固原苜蓿发病最轻,但是不同品种上病害的发生和发展趋势是相同的;褐斑病的季节消长曲线呈“S”型,5月底、6月初为病害的始发期,7、8月为盛发期,9月进入衰退期,整个生长季节中病害的增长速度以8月上中旬最快,7月下旬和8月下旬次之,7、8月是褐斑病发展的关键期。刈割措施影响病害的发生和发展。适时、合理应用刈割措施是延缓、减轻和控制褐斑病危害的有效措施。     

苜蓿抗褐斑病遗传资源离体叶筛选及田间评价

对5个苜蓿遗传材料各600株的离体叶,经过6次对苜蓿褐斑病的抗性循环筛选,在每个遗传材料内筛选出最抗病的5株,并用同样方法选出最感病和随机单株各5株以及亲本材料在田间进行抗病性和干物质产量的比较和评价。结果表明,所筛选出的抗病组后代病情指数显著低于原始亲本及最感病株和随机组的后代,并且干物质产量显著高于原始亲本及感病和随机组后代,证明离体叶接种法是苜蓿抗褐斑病株系筛选的高效而可靠的方法。     

48个苜蓿品种对3种病害抗性的初步评价

在兰州大学榆中校区品种比较试验田,以发病率为指标,采用国际上通用的苜蓿病害抗病性评价的分级标准,比较了国内外48个苜蓿品种对褐斑病、霜霉病和锐顶镰刀菌根腐病的抗病性,并对其进行了综合评价.抗病性等级评价结果表明,不同苜蓿品种对褐斑病的抗性表现是UC-1465为高抗(HR)品种,UC-1887为抗病(R)品种,Siriv...     

苜蓿对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性评价研究

为探明不同紫花苜蓿品种对匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的抗性,本研究采用温室内孢子悬浮液喷雾接种法,对来自国内外的40个苜蓿品种进行了苗期抗病性鉴定和评价,同时,对接种浓度进行研究。研究结果表明,随着孢子悬浮液浓度的升高,10个品种匍柄霉叶斑病与茎点霉叶斑病的病情指数均呈现逐渐升高的趋势,匍柄霉叶斑病的适宜接种浓度为1×10⁵~1×10⁶个孢子/mL,茎点霉叶斑病的适宜接种浓度为1×10⁶个孢子/mL。在1×10⁶个孢子/mL 的接种浓度下,40个苜蓿品种匍柄霉叶斑病的病情指数为3.33~35.83,茎点霉叶斑病的病情指数为13.07~52.27,品种间均存在显著差异(P<0.05)。从中筛选出抗匍柄霉叶斑病品种14份,其中,高抗品种1份(公农2号),中抗品种13份;从中筛选出抗茎点霉叶斑病品种1份,为来自美国的中抗品种润布勒。     

天祝县燕麦叶斑病的发生情况及其病原鉴定

叶斑病（Drechslera avenacea）是燕麦（Avena sativa）的重要病害之一,严重影响燕麦的品质和产量。天祝藏族自治县是甘肃省燕麦的主要种植区,为明确这一地区叶斑病的发生情况及其病原菌种类,本研究对天祝县5个村镇的燕麦田进行了叶斑病发生情况调查和病样采集,对病原菌进行了致病性测定、形态特征观察和rDNA-ITS序列分析。结果表明,5个调查区域中松山镇黑马圈河村和东大滩乡上泉村发病最严重,病叶率高达92%以上,病情指数60以上;安远镇柳树村、抓喜秀龙乡南泥沟村和东大滩乡酸茨沟村发病也较重,发病率在64%左右,病情指数23左右。经分离鉴定,发现引起天祝县燕麦叶斑病的病原菌共有4属5种,其中德氏霉属（Drechslera）2种,链格孢属（Alternaria）、附球菌属（Epicoccum）和枝孢菌属（Cladosporium）各1种。天祝县燕麦叶斑病发病较严重,共分离筛选出的5种病原菌,除德氏霉属的燕麦内脐蠕孢（Drechslera avenae）外,其它病原菌在国内燕麦上未见报道。