家蚕AGO2蛋白的单克隆抗体制备

Argonaute(AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择Bm AGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础。通过分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,筛选出Bm AGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体p ColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合。以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3。经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的Bm AGO2单克隆抗体。利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞Bm N以及家蚕5龄幼虫的内源Bm AGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA。     

感染二分浓核病毒家蚕相关MicroRNA的筛选与鉴定

二分浓核病毒(bidensovirus,BDV)是家蚕病毒病的主要病原之一。为了筛选和鉴定家蚕体内与BDV感染相关的差异表达microRNA(miRNA),对家蚕品种JS的3龄起蚕添食BDV,36 h后收集家蚕并提取总RNA,采用高通量测序技术分析家蚕感染BDV后应答的miRNA,从中筛选出24个显著差异表达的miRNA,其中14个为已知miRNA,10个为新发现的miRNA。进一步利用反转录PCR(RT-PCR)技术对上述24个miRNA进行验证,发现这些miRNA均在家蚕幼虫体内表达;利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测家蚕感染BDV后这些miRNA的表达情况,发现其中9个miRNA表达上调,15个miRNA表达下调,其中表达上调倍数最高的为bmo-miR-1923,相对表达上调了8.87倍,表达下调倍数最高的为bmo-miR-13b-3p,相对表达下调了6.97倍。此外,根据测序结果进行生物信息学预测和分析差异表达miRNA的靶基因,并利用GO分析对靶基因进行功能分类,发现这些靶基因主要参与了细胞过程、催化、结合和代谢过程。研究结果将为阐明家蚕抗BDV的分子机制提供数据参考和技术支持。     

家蚕二分浓核病毒DNA聚合酶基因启动子P97的研究

家蚕浓核病毒2型(BmDNV-2)已被正式命名为家蚕二分浓核病毒(BmBDV),该病毒致使家蚕罹患浓核病。BmBDV是目前已知唯一能够编码DNA聚合酶的ssDNA病毒,DNA聚合酶的表达对该病毒复制至关重要。使用双荧光素酶报告系统检测BmBDV DNA聚合酶基因启动子P97的活性以及病毒潜在的调控蛋白或宿主的互作蛋白对P97的调控作用。BmBDVDNA聚合酶翻译起始位点上游286 nt序列具有启动子活性,但其活性比病毒非结构蛋白NS1基因启动子P5的活性弱。共转染瞬时表达病毒的NS1蛋白使P97启动子活性降低,而病毒的结构蛋白VP则可提高P97启动子活性;宿主家蚕的转录因子Twist蛋白的表达能够提高P97启动子的活性,但其调控作用较小。     

抗禽流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

为制备抗禽流感病毒(AIV)NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位鉴定,本研究以原核表达并纯化的NS1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,制备的D7和D9 2株能够稳定分泌抗NS1蛋白MAb的杂交瘤细胞,亚型鉴定均为IgG1型,轻链均为k链.Western blot鉴定表明,这2株MAbs均能够识别NS1重组蛋白.间接免疫荧光鉴定表明,这2株MAbs均能够识别真核表达的NS1蛋白.利用噬菌体展示技术得到D9对应的短肽WNLNTV,与NS1蛋白aa 182～aa 187基本匹配,提示182WNDNTV187为NS1蛋白的一个线性表位.该结果为进一步研究NS1蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础.     

家蚕浓核病毒的研究

<正> 家蚕浓核病与传染性软化病由于其外部症状,发病规律及病毒形态均十分相似,因而长期以来两者混淆不清。七十年代中期日本把家蚕浓核病毒(DNV)作为传染性软化病病毒(FV)的一个毒株,七十年代后期通过对病毒的生化分析才确认这是两类完全不同的病毒,最近在日本除浓核病毒伊那株外,又分离出了山梨标及佐久株,这些病毒虽然都是以单链DNA为核酸的浓核病毒,但其抗原性、病原性及病毒结构蛋白分子量则各不相同。我国在1959年先于日本证实生产上所发生的家蚕空头性软化病是由病毒引起,1979年起我们开始对本病毒进行了较系统而深入的研究。     

家蚕浓核病毒的研究

家蚕浓核病毒是一种使蚕发生软化病的病原,主要感染家蚕的中肠圆筒型细胞。家蚕浓核病毒可作为基因转移、表达的载体和农林害虫的生物防治,同时也是家蚕的四大病毒性疾病之一,对蚕桑生产危害巨大。现就病理学特征、基因组结构、感受性、检测方法和浓核病的防治等方面对家蚕浓核病毒进行概述。     

日本乙型脑炎病毒抗NS3和NS5蛋白单克隆抗体的制备

本研究在大肠杆菌中表达了日本乙型脑炎病毒(JEV)非结构蛋白NS3和NS5,并纯化NS3和NS5蛋白,免疫小鼠获得脾淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合筛选得到2株抗NS3蛋白单克隆抗体1H7和2D4,3株抗NS5蛋白单克隆抗体3C4、3H7和3F10。试验通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western blotting和间接免疫荧光检测(IFA)检测了单克隆抗体的活性。结果显示,所有的单克隆抗体1∶100稀释进行IFA和1∶500稀释进行Westernblotting时均具有高特异性和高敏感性。抗JEV NS3和NS5蛋白单克隆抗体的成功制备为进一步研究JEV的蛋白结构和致病性奠定基础。     

抗乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1单克隆抗体的制备与鉴定

本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2株非结构蛋白NS1作为免疫原.免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,共获得4株特异性针对JEV NS1的杂交瘤细胞,分别命名为1H6、2C3、3A7、4C8,经测定1H6单抗亚类属于IgG2b,其他3株为IgG1,轻链均为K链.4株杂交瘤细胞诱生小鼠腹水效价分别达1:20 480、1:2 560、1:20 480、1:10 240,western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体均可与JEVNS1蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光试验表明1H6、3A7、4C8 3株单抗能够识别天然的JEV NS1蛋白.本研究为进一步探究JEV NS1蛋白结构及其功能奠定了基础.     

家蚕浓核病毒DNA的研究

<正> 家蚕浓核病毒(DNV)属于细小病毒科(Parvoviridae)浓核病毒属(Denso-virus)。我们对该病毒进行过一些工作。本文进一步报告其DNA分子量和限制性酶切试验。 DNA感染的家蚕中肠20克,-20℃冷冻。取出融化后,加0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.5)100毫升,组织捣碎机匀浆后,经6,000g离心8分钟。上清液用等体积冷氯仿     

沙门氏菌属特异性单克隆抗体的验证试验

用间接ＥＬＩＳＡ测试了沙门氏菌特异单克隆抗体与１０７株肠杆菌科细菌的反应性，结果被试的１４个血清型的单相亚利桑那菌，３５株全国各地分离的鼠伤寒伤沙门氏菌及３血清型的其他沙门氏菌全部呈阳性反应，而５５株其他肠杆菌科细菌中仅有３株呈弱阳性反应，从而进一步证明了该试利较高的沙门氏菌属特异性和属内的广谱性，显示出其广阔的应用前景。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

用基因工程表达的牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白免疫Balb／C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选,获得3株稳定分泌抗BVDVNS3蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1A9、2C3和5D5）,其细胞培养上清液ELISA效价分别为1：256、1：128和1：256,腹水ELISA效价分别为1：128000、1：64000和1：128000。亚型鉴定表明,1A9、2C3和5D5分别为IgG1、IgG2a和IgG1、ELISA结果显示,3株单克隆抗体仅与BVDVNS3蛋白和BVDV反应,不与其它相关病毒反应,表明3株单克隆抗体特异性良好。这3株单克隆抗体的获得为建立BVDV免疫学检测方法奠定了基础。     

弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的重组表达和特异性单克隆抗体制备

为研究制备弓形虫卵囊壁蛋白和特异性单克隆抗体,以弓形虫弱毒株ME49株DNA为模板,应用PCR技术扩增卵囊壁蛋白OWP1基因,将其克隆至原核表达载体构建重组表达质粒p ET-28a-OWP1,经过IPTG诱导表达和His纯化树脂纯化重组蛋白His-OWP1。重组蛋白His-OWP1作为免疫原,免疫7周龄雌性BALB/c小鼠,重组蛋白GST-OWP1作为检测筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的单克隆抗体。结果表明,获得2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株(4A2和2C10)。Western blot结果表明研究制备的单克隆抗体能够识别重组表达蛋白。制备获得的2株稳定性好、效价高的单克隆抗体,可为今后研究特异敏感的弓形虫病血清学检测方法提供材料。     

抗猪瘟病毒NS3(p80)蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达猪瘟病毒石门株NS3基因部分功能片段,以纯化的重组NS3（p80）蛋白免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,经间接ELISA筛选及3次连续克隆化获得了4株可分泌抗NS3单抗的杂交瘤细胞（2G7,2F11,5D2和6F11）,通过小鼠体内诱生法制备腹水,并对杂交瘤细胞和单克隆抗体的特性进行鉴定。结果表明,杂交瘤细胞染色体正常,抗体分泌稳定,单抗效价高,亲和力各不相同,Ig亚类鉴定均为IgGl。Western blot分析证明4株单抗均能与原核表达的NS3蛋白特异性结合,6F11株与真核表达的NS3蛋白有较强的特异性反应。     

制备双特异性单克隆抗体的方法

双特异性抗体由于其独特的结构－2个不同抗原，引起研究机构的广泛重视。研究者将治疗药物和针对疾病部位的特异目标分别放在双特异性单克隆抗体的2个臂上。治疗药物可以是药品、毒素、酶、DNA和放射性核素等。双特异性单克隆抗体能使免疫效应细胞的细胞毒性作用于致病细胞或者诱导产生全身免疫应答。作者重点介绍了制备双特异性单克隆抗体的3种方法，分别是化学方法、生物方法和基因工程，为制备临床需要的抗体奠定坚实的理论基础。     

血清1型马立克氏病病毒单克隆抗体的制备及其特异性鉴定

为制备血清1型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）单克隆抗体,以超速离心浓缩的血清1型MDV CVI988/Rispens毒株免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过亚克隆、间接ELISA和间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay, IFA）筛选,获得3株分泌抗血清1型MDV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为4D9、1C5和1F10,并对其进行特异性分析。间接ELISA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水ELISA效价分别达5.1x104、8.2x105、4.1x105,可用于后续建立ELISA检测方法;IFA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水与不同血清1型MDV毒株具有良好的反应性,效价可分别达1: 12800、1: 25600和1: 12800,与血清3型MDV毒株和其他常见禽源病毒均没有交叉反应,特异性良好;亚型检测结果显示,4D9抗体为IgG2a/κ型,1C5抗体为IgG2b/κ型、1F10抗体为IgG1/κ型;应用1C5建立的IFA方法能检出至少5PFU CVI988/Rispens毒株感染,适用于血清1型MDV的检测。综上,制备的单克隆抗体可用于血清1型MDV的检测,为MDV致病机制研究及诊断试剂研发提供基础。     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10和2B10。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test,IFAT)和Western-bloting分析证实所获得的单克隆抗体是特异针对家蚕微孢子虫蛋白的,将在孢子孢壁蛋白的研究中发挥重要作用。     

家蚕对浓核病毒的抗性机制及浓核病毒胚胎传染可能性的初步研究

运用核酸分子杂交的方法,探明了BmDNV—DNA不能在抗性品种蚕细胞中复制增殖,蚕对DNV的抗性是侵染抵抗性,BmDNV不具有胚胎传染的途径。