云南致病疫霉交配型、甲霜灵敏感性、mtDNA单倍型及其群体演替研究

【目的】对致病疫霉群体特征的认识，是控制晚疫病危害的必要前提。【方法】对云南32个马铃薯和番茄产区的致病疫霉群体的交配型、甲霜灵敏感性、mtDNA单倍型进行了研究。【结果】云南马铃薯致病疫霉群体主要由A1交配型组成，番茄致病疫霉全部为A1交配型。A2 交配型和自育型菌株总体发生频率较低，分别为3.4％和4.4％。自从2002年以后，致病疫霉的群体结构发生了明显的变化，没有检测到A2交配型或自育型菌株。致病疫霉对甲霜灵敏感性的离体测定显示马铃薯和番茄上均存在抗性、中抗和敏感菌株。甲霜灵抗性、中抗、敏感菌株分别占测定菌株的13.2％ 、9.4％和 77.4％。分离自番茄的甲霜灵抗性菌株比例高于分离自马铃薯的菌株。Ⅰa 、Ⅱa 和 Ⅰb 三种mtDNA 单倍型被检测到，马铃薯致病疫霉有Ⅰa 和 Ⅱa 两种单倍型，全部为第二次全球迁移后出现的“新”群体。Ⅰa 单倍型在群体中的比例为96％，分布于所有马铃薯产区；番茄致病疫霉则为Ⅰa 和Ⅰb 两种单倍型，“新”、“旧”群体共存。【结论】马铃薯和番茄致病疫霉群体的遗传结构有明显差异；致病疫霉“新”、“旧”群体在云南已发生演替，马铃薯致病疫霉“新”群体已成功替代了“旧”群体；迁移和有限的有性生殖可能在云南致病疫霉群体的演替中担当了重要的作用。     

利用PCR技术测定东北、华北致病疫霉线粒体单倍型

为了明确东北、华北地区致病疫霉群体的线粒体单倍型组成与多样性,采用PCR的方法对2013年采自两地区5省(区)的163株致病疫霉菌株的线粒体单倍型进行了测定和分析。由高变区HVRi所区分的Ⅰ型菌株所占比例为38.65%,Ⅱ型菌株占61.35%；高变区HVRii所区分的R1型、R2型和R3型菌株所占比例分别为1.85%、4.90%和93.25%。东北和华北两地区的优势线粒体单倍型均为ⅠR3型与ⅡR3型,其在群体中的比例分别为36.81%和56.44%。不同省(区)间致病疫霉线粒体单倍型组成存在一定差异,ⅡR2型菌株仅在河北和辽宁省有少量分布,所占比例仅为4.91%；ⅠR1型菌株仅存在于黑龙江,所占比例仅为1.84%。东北和华北地区致病疫霉线粒体单倍型整体表现一致,不同省(区)之间多态性不同,说明致病疫霉的线粒体单倍型与地理来源之间有很大关系。     

致病疫霉(Phytophthora infestans)的分离与培养方法

针对不同地区的病样,分别采用直接分离法、保湿培养分离法、薯片夹叶分离法、薯片诱导分离法等分离方法,利用选择性培养基SRA进行分离,通过挑取菌落边缘菌丝尖端于斜面培养基进行纯化,共获得重庆马铃薯和番茄主产区186个致病疫霉菌株。测定代表性菌株在不同培养基上的菌落生长和产孢量。结果表明,致病疫霉在RSA上生长最快,RA和RSB次之;在RSB上产孢最多,RTA次之。     

我国北方马铃薯主产区致病疫霉群体遗传结构分析

将细胞核染色体DNA和细胞质线粒体DNA遗传多态性相结合,利用SSR分子标记和以PCR为基础的线粒体单倍型测定技术,对我国北方5个省(区)的82株致病疫霉群体的分子遗传多样性进行了测定与评价。结果表明,82株供试致病疫霉中发现G-01—G-18等18个SSR基因型和ⅠR3、ⅡR3、ⅠR1、ⅡR2、ⅠR25种线粒体单倍型。华北、东北和西北3个地区的致病疫霉各具有其优势SSR基因型,分别为G-01、G-04和G-18。除宁夏外,河北、黑龙江、吉林和内蒙古各省(区)又分别具有几个独特的SSR基因型。ⅠR3、ⅡR3和ⅠR1为供试菌株中主要的线粒体单倍型。华北与东北地区的致病疫霉以R3型为主,而西北地区则以R1型为主。Ⅰ型和Ⅱ型在华北和东北地区比例相差不大,而在西北地区除1株菌株为Ⅱ型外,其余均为Ⅰ型。这表明我国北方马铃薯主产区致病疫霉群体存在着较为丰富的遗传多样性,且其多样性与地理来源密切相关。     

假单孢菌20#-5菌株对致病疫霉的作用

通过不同浓度的发酵液对致病疫霉生长影响的检测和对马铃薯晚疫病菌孢子萌发的影响试验,发现假单孢菌20#-5菌株对致病疫霉的抑菌机制主要是抑制菌丝的生长及孢子的萌发,2.86%的发酵液的抑制率可达60%以上,高浓度的发酵液对病菌菌丝的生长起抑制而非杀死作用。通过离体叶片试验和盆钵试验,发现此菌株发酵液的主要成分对作物主要起保护作用。     

福建、湖南自育型致病疫霉生物学特性研究

[目的]对分离自马铃薯晚疫病组织的自育型致病疫霉的生物学特性开展研究,为自育导致的有性生殖对马铃薯晚疫病菌群体结构的可能影响提供参考。[方法]测定致病疫霉菌株的交配型,观测并比较自育型菌株在黑麦培养基上和马铃薯叶片组织内产生卵孢子的状况,并通过MTT染色法测定卵孢子的活性。[结果]2014至2016年,自育型(A1A2)致病疫霉在福建省霞浦县、福安市和湖南省永顺县的比例呈显著的上升趋势,至2016年达到100%,且自育性状在单游动孢子无性系后代中稳定遗传;2015—2016年的自育型菌株在黑麦培养基上产生卵孢子的败育率高达74%~100%,自育型致病疫霉单孢株在马铃薯叶片组织内产生的具活性的健康卵孢子比例则达到54%~68%,显著高于黑麦培养基上产生的健康卵孢子的比例。[结论]致病疫霉自育型群体已成为福建霞浦、福安和湖南永顺地区的优势群体,自育型致病疫霉在马铃薯叶片组织内能产生大量具活性的健康卵孢子。提示:大量A1A2型菌株出现可能对以上地区致病疫霉的群体遗传结构产生影响。     

辽、冀、鲁黄瓜褐斑病菌(Corynespora cassiicola)培养性状及致病力分化研究

对分离自辽、冀、鲁三省43个市(区)的黄瓜褐斑病菌[Corynespora cassiicola(BerkKert)Wei]菌株进行培养性状观测和致病力分化研究,结果表明:供测106个菌株的菌丝生长速率分为快、中、慢3种类型,菌株数依次为65株(占61.32%)、37株(占34.91%)和4株(占3.77%);气生菌丝类型分为密集型和几无菌丝型,菌株数分别为88株(占83.02%)和18株(占16.98%);菌落颜色表现深墨绿、深褐、灰、浅灰和白色等多样颜色,以灰色和浅灰色为多;菌株色素分泌情况包括无色素分泌(菌株65株,占61.32%)和分泌土黄色、微红色和酒红色色素等性状;产孢能力试验表明,几无菌丝型菌株整体产孢能力高于气生菌丝密集型菌株。致病力测定研究表明,供试106个菌株可分为3种致病类型,即强致病力类型(29株,占27.36%)、中等致病力类型(70株,占66.04%)和弱致病力类型(7株,6.60%),其中,来自辽宁的菌株均属强或中等致病力类型,而来自河北和山东的菌株都有强、中、弱致病力类型的划分,但来自河北的菌株大多数为中等或弱致病力类型,来自山东的菌株几乎皆为强或中等致病力类型。综上,供试菌株的培养性状呈现丰富多样性,且与致病力类型密切相关,与菌株地理来源也有一定的相互关联;除色素分泌这一因素外,菌株的生长速率、气生菌丝类型及产孢能力与形成病斑的大小形状等也存在相关性。     

甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成及其对甲霜灵的抗药性

为了明确甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成与对甲霜灵的抗药性,采用生长速率法对2007-2012年采集标样中分离到186株致病疫霉菌进行甲霜灵抗药性测定,利用对峙培养法对147株代表性菌株进行交配型测定。结果表明:甘肃省马铃薯致病疫霉交配型由A1、A2、A1A2交配型和自育型菌株组成,分别占被测菌株的61.20%、20.40%、2.10%、16.30%;186株致病疫霉中28.50%的菌株对甲霜灵表现敏感,15.60%表现中抗,55.90%表现高抗。甘肃省马铃薯致病疫霉交配型组成复杂,各采集地组成差异较大,对甲霜灵表现抗药性的菌株普遍存在各采集地。     

不同培养基对辣椒疫霉致病力的影响

辣椒疫霉的菌落形态、生长速率、产生孢子囊的能力、致病力的强弱与培养基种类有很大关系。其中在燕麦片培养基上生长最快 ,致病力也最强 ,但致病力的强弱与菌丝生长速率没有关系 ;菌株在同一培养基 (营养条件 )下生活一定时间后 ,其致病力强弱发生了分化 ,认为营养条件是影响辣椒疫霉致病力分化的因素之一     

内蒙古马铃薯晚疫病菌基因型多样性分析

为了解和探讨我国内蒙古马铃薯晚疫病菌的基因型多样性,对1997～1999年和2002～2003年采自内蒙古马铃薯主栽区的40个马铃薯晚疫病菌株进行了线粒体DNA单倍型和AFLP分析。结果表明,所有马铃薯晚疫病菌株的线粒体DNA单倍型均为Ⅱa型,说明Ⅱa型可能是目前内蒙古马铃薯晚疫病菌的主要类型,同时病菌群体结构为新的群体结构;所有供试的40个马铃薯晚疫病菌株可划分为17种AFLP基因型,平均每2个菌株为1个特有的基因型,17种基因型分布于3个组中,菌株的亲缘关系与病菌的地理来源、采集年份无相关性。     

马铃薯致病疫霉及其拮抗菌的筛选与鉴定

采用组织分离法分离鉴定马铃薯致病疫霉,同时比较3株拮抗菌对马铃薯致病疫霉的抗菌效果,以期获得1株更具有生防潜力的拮抗细菌,并加以鉴定。用涂布分离法得到3株拮抗菌,通过形态学和分子生物学鉴定马铃薯致病疫霉和这3株拮抗菌。同时比较这些拮抗菌对马铃薯致病疫霉游动孢子释放、休止孢萌发和孢子囊直接萌发的抑制效果,分析菌液对马铃薯晚疫病的预防效果。结果鉴定出1株马铃薯致病疫霉PLB-2 Phytophthora infestans和1株具有明显抑制效果的拮抗细菌WZ-502 Brachybacterium sp.。菌株WZ-502的菌液对马铃薯致病疫霉游动孢子释放、孢子囊直接萌发和休止孢萌发有较好的抑制效果。菌株WZ-502菌液浓度为3.65×10⁷ CFU·mL^-1、稀释度为10^-2～10^-3时,对马铃薯致病疫霉的抑制效果均明显,稀释度为10^-3时,马铃薯致病疫霉孢子囊萌发率和释放率均在40%以下。因此,菌株WZ-502对马铃薯致病疫霉抗菌效果显著,具有一定的生防潜力。     

绿色木霉HT-01的生物学特性和抑菌特性

从淮安市城南栽培番茄的菜园土中分离出绿色木霉HT-01,研究不同培养条件对该木霉菌丝生长和孢子产生的影响,以及该木霉对番茄灰霉病的抑制效果.结果显示,25℃、pH为5时最有利于菌丝生长和产孢;葡萄糖和蔗糖为菌丝生长和产孢的最佳碳源;光照处理对菌丝生长影响不明显,但明显促进孢子产生;菌株在玉米粉培养基上生长最快,但在纯糠培养基上产孢量最大.木霉HT-01对番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers)的抑制率为0.452±0.020,用木霉HT-01孢子悬浮液喷布番茄叶面和灌根处理接种灰霉病菌的番茄幼苗,使叶片感病率分别降低38.1%和42.1%,植株感病率分别降低15%和20%.     

香蕉棒孢霉叶斑病病原菌生物学特性测定

[目的]明确香蕉棒孢霉叶斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola(Berk&Curt)Wei]的生物学特性,为香蕉棒孢霉叶斑病的综合防治提供科学依据.[方法]以采集自云南省香蕉种植区的香蕉棒孢霉叶斑病病叶片为材料,采用常规组织分离法进行病原菌单孢分离,并对病原菌进行形态特征观察及致病性测定;应用平板培养法进行病原菌生物学特性测定.[结果]香蕉棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA);最适碳源为乳糖和甘露醇,最适氮源为蛋白胨;适宜温度为25~35℃,最适温度为28℃;病原菌仅能在pH 6~8内生长,最适pH为7;光照处理对菌丝生长有一定影响,以全黑暗条件下病原菌菌丝生长最快.在玉米粉培养基(CMA)上病原菌产孢量最高,光照与黑暗交替有利于产孢.病原菌菌丝致死温度和时间为58℃处理15 min,分生孢子的致死温度和时间为51℃处理5 min.[结论]香蕉棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长温度范围较宽,偏好高温,但适应的pH较窄;病原菌产孢的关键因子是培养基营养成分和光照条件.     

生防木霉菌T41菌株生物学特性研究

木霉菌T41菌株是一株分离于土壤中的具有生防潜力的木霉菌株,为进一步研究菌株的发酵培养及田间应用技术提供理论依据,进行了菌株生物学特性研究.采用室内菌丝生长、产孢测定方法研究了T41菌株生物学特性,结果表明:T41菌株在PDA、PSA、PMA、NA、查彼培养基和基本培养基上均能生长,但在PDA培养基上菌丝生长和产孢最佳,菌落直径达到81mm,产孢量达到2.6×1010个;温度对菌丝生长和孢子产生影响显著,在10～40℃范围能够生长产孢,以30℃时菌丝生长最快,培养2d后菌落直径达到93mm,并且产孢量也高于其他培养温度;光照处理对菌丝生长影响不明显,但光照可明显促进孢子产生.葡萄糖、木糖、果糖和麦芽糖能够较好促进菌丝生长,葡萄糖和果糖是T41菌株产孢的最佳碳源;蛋白胨、天冬酰胺是有利于菌丝生长和孢子产生的有机氮源;微量元素中Ca、Cu对菌丝生长及产孢都有一定的促进作用,而Mn、Zn则不利于T41菌丝生长和产孢;菌株在pH值2～11的范围均可以生长产孢,但偏酸性条件是T41菌株生长产孢的适宜环境,pH值5为最佳.     

宜宾烤烟赤星病致病力分化、生物学特性及抑菌药剂筛选研究

为了使生产上对烟草赤星病的防治更有针对性,对采自宜宾市烤烟种植区的具有典型赤星病症状的烟叶样品进行了组织分离、培养和形态特征观察。采用菌丝块创伤接种法测定分离菌株的致病性,同时采用菌丝生长速率法测定了不同致病力的菌株xs-k-1(较强)、xz-k-1(中)和xf-y-1(弱)的生物学特性及4种杀菌剂对较强致病力菌株xs-k-1的室内抑制效果。结果表明:21个菌株均属于链格孢菌,但各菌株间的致病力有明显的差异,平均病情指数为18.75~71.25,其中以中等致病力类型的菌株为主,占测试菌株的61.9%,弱致病力类型和较强致病力类型的菌株所占比例相当,未发现强致病力和不致病力菌株。在人工培育条件下,烟草赤星病菌在7~35℃的温度范围内均能生长和产孢,最适宜的生长和产孢温度为21~28℃;高湿度有利于病菌的生长和产孢,当湿度为100%时,病菌生长和产孢量最高,分别为5.83 cm和4.18×105个·m L-1;在p H值4~10的范围内该病菌均能生长和产孢,适宜p H值范围为7~8.5,其中病菌生长的最适p H值为8.5,产孢量最大的p H值为7。供试药剂的室内平板抑菌效果为:10%多抗霉素60%唑醚·代森联50%氯溴异氰尿酸40%菌核净,10%多抗霉素的EC50为15.182μg·m L-1。     

球孢白僵菌不同分离株生物学特性及对茶丽纹象甲成虫的杀虫活性研究

测定了从球孢白僵菌侵染的茶丽纹象甲虫尸上分离的8个分离株的生长速率、产孢量和孢子萌发率等生物学性状,以及对茶丽纹象甲成虫的杀虫活性,旨在筛选出感染该虫的高致病力菌株.结果表明:在萨氏培养基(SDAY)上,8个分离株从菌落形态上可分为菌丝型和孢子型两类.其中,菌丝型菌株XJBb3001和XJBb3007生长速率最快,但菌...     

黑龙江省马铃薯晚疫病菌交配型、瑞毒霉敏感性及mtDNA单倍型分析

2012~2014年在黑龙江省各马铃薯主产区共分离了151株马铃薯晚疫病菌,并测定了晚疫病菌的交配型、瑞毒霉敏感性和mt DNA单倍型。交配型测定结果显示,分离的151株马铃薯晚疫病菌中,A1交配型为103株(68.2%),自育型为33株(21.9%),A2交配型为15株(9.9%)。这说明黑龙江省马铃薯晚疫病菌的群体结构发生了明显的变化。瑞毒霉测定结果显示,2012~2014年分离的151株菌株中敏感性菌株占3.3%,中抗菌株占6.6%,抗性菌株占90.1%,表明黑龙江省部分马铃薯主产区分离的晚疫病菌已对瑞毒霉产生抗药性。线粒体DNA单倍型的测定结果显示在黑龙江省部分马铃薯主产区共发现了3种线粒体DNA单倍型,分别为Ia,Ib和IIa。其中,IIa mt DNA单倍型的数量最多,发生频率为86.1%。这说明IIa mt DNA单倍型是黑龙江省部分马铃薯主产区的优势种群。     

生防木霉菌Tr11菌株适宜生长条件研究

对木霉菌菌株Tr11室内菌丝生长、产孢的适宜条件进行了研究,结果表明:Tr11菌株在PDA培养基上生长最好,产孢最多;25℃下菌丝生长最快,15~30℃下均可大量产孢;黑暗可促进菌丝生长,但有无光照对孢子产生影响不明显;果糖是菌丝生长最好的碳源,乳糖是Tr11菌株产孢的最佳碳源;蛋白胨、硫酸铵是有利于菌丝生长和产孢的有机氮源;微量元素中Ca、Cu对菌丝生长及产孢都有一定的促进作用;pH值5最适宜菌丝生长,pH值6~8适宜产孢。     

致病疫霉ATP6基因单倍型与地理因素的相关性分析

致病疫霉(Phytophthora infestans)是马铃薯晚疫病的病原菌,对世界马铃薯的生产造成严重影响。ATP6编码ATP合酶α亚基的第6个亚单位,对ATP合酶的功能及生物的生存生殖至关重要。本研究对来自我国7个群体140株马铃薯晚疫病菌的ATP6基因进行核苷酸序列及其遗传结构和地理因素(海拔、经度和年平均气温)的相关分析。结果表明:7个群体中只有2种单倍型Hapl-1和Hapl-2,其中Hapl-1在群体中所占比例与当地的海拔呈显著正相关,与年平均气温和经度呈显著负相关,而Hapl-2在群体中的比例与当地的海拔、年平均气温和经度的相关正好与Hapl-1相反。群体间的遗传分化度(FST)与群体间直线距离呈显著正相关(r=0.659,P=0.001)。本研究表明,马铃薯致病疫霉ATP6基因单倍型分布和群体地理因素之间具有显著相关关系,该结果为了解致病疫霉的进化趋势和致病疫霉的防治提供了理论依据。     

致病疫霉拮抗放线菌的筛选及抑菌作用初步研究

为获得对致病疫霉具有显著且稳定拮抗作用的放线菌,利用对峙培养法和滤纸片法测定了从土壤中分离纯化出的放线菌活体及其发酵液对致病疫霉生长的抑制作用,并对其中抑菌效果显著的Sy11菌株的抑菌方式、对致病疫霉的感应性、传代稳定性以及对致病疫霉菌体形态的影响进行了初步研究。结果表明,分离纯化出的74株放线菌中有17株对致病疫霉具有拮抗作用,但其发酵液对致病疫霉均无抑制作用;Sy11菌株只有感应到致病疫霉存在时才分泌对致病疫霉的抑菌物质;连续传代25次后,Sy11菌株的抑制率仍然保持在81%以上;Sy11菌株可导致致病疫霉菌丝体严重变形,但只是抑制其生长,并未杀死致病疫霉。这些结果表明,Sy11菌株在防治马铃薯晚疫病方面具有较大的应用潜力。